攻克ELISA实验，你需要搞定这些问题

病理医师

LISA是蛋白定量的金标准，也是免疫学研究中最常用的实验方法之一。很多人觉得ELISA很简单，其实不然。东澳生物带你绕开ELISA实验中出现的各种问题，轻松搞定ELISA实验~



酶联免疫吸附实验
1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者VanWeerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)。
酶联免疫吸附（ELISA）用于：
（1）免疫酶染色各种细胞内成份的定位；
（2）研究抗酶抗体的合成；
（3）显现微量的免疫沉淀反应；
（4）定量检测体液中抗原或抗体成份。
优点：快速、灵敏、定性、定量、定位
实验原理



1.包被：抗原/抗体，固相化
2.反应： 1)待测抗体/抗原； 2)酶标抗原/抗体
3.洗涤：使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离
4.底物显色：定性/定量分析
常用的酶与底物：
酶底物显色测定波长辣根过氧化物酶horseradish pero
xidase,HRP邻苯二胺（OPD）橘红色492nm四甲基联苯胺（TMB）黄色450nm碱性磷酸酶alkaline phosohatase,AP4-硝基酚磷酸盐(p-NPP)黄色405nm终止液：2mol/L  H2SO4
常用方法
1.间接法
检测抗体最常用的方法, 主要用于对病原体抗体的检测。
优势：二抗可以加强信号，而且有多种选择能做不同的测定分析。不加酶标记的一级抗体则能保留它最多的免疫反应性。
缺点：交互反应发生的机率较高



2.双抗体夹心法
检测大分子抗原最常用的方法。
优势：高灵敏、高专一性，抗原无须事先纯化。
缺点：抗原一定得拥有两个以上的抗体结合部位。



3.竞争法
检测小分子半抗原（药物、激素等）。
优势：可适用比较不纯的样本，而且数据再现性很高。
缺点：整体的敏感性和专一性都较差。



常见问题分析
Q1.标曲不显色或显色很弱，样本显色
溶解标准品以及倍比稀释时，未涡旋震荡或不够充分。
标准品溶解、倍比稀释时均需要涡旋震荡以保证充分混匀。单纯依靠移液器反复吹打，效率较低、效果也不一定最佳。
Q2.标曲和样本均不显色
在孵育阶段静置在桌面上，这样非常不利于抗原抗体之间的充分接触，导致显色偏弱。
推荐孵育阶段，使用ELISA专用的微孔板振荡器，调至合适的频率，使抗原抗体充分接触，保证结合效果。如果排除上述原因，有可能是漏加了某个组分，如检测抗体、酶等。对于比较马虎的新手，一定要做好标记和记录，或者使用添加染料的ELISA试剂盒。
Q3.标曲显色，样本不显色
当样本中目的蛋白浓度极低或者样本中干扰因素较强，就无法检测到。目前ELISA仍然是蛋白检测灵敏度最高的方法，与不同技术结合后，衍生出了多种类型的ELISA，提高了检测灵敏度。
对于目的蛋白浓度特别低的样本，可以尝试用高敏ELISA，但这也并不意味着一定能检测到样本浓度，只能说可以提高样本的可测率，并使结果更加可靠。因为通常用普通ELISA检测的样本OD值都偏低，而高敏ELISA可提高样本OD值，使之尽量位于标曲范围内，得到的数值也更加可信。
Q4.标曲和样本都显色，但复孔的CV大
这个问题就跟移液器和实验者的操作有关了。移液器的使用维护不规范，就会造成移液的误差较大；实验者自身的操作习惯、加样的一致性对复孔的CV也有很大影响。
掌握移液器的正确使用和维护。关于个人的操作可练习移液动作、加快速度，确保移液的精密度。
Q5.本底偏高，样本值测不到
标曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(对于高敏ELISA可以适当放宽要求)。尤其是样本值特别低的时候，本底过高会掩盖目的信号，导致无法测到样本值。
在加入TMB显色后，需实时观察标曲显色情况。通常在S5孔有肉眼可见的微弱蓝色，即可终止反应。
Q6.样本经不同梯度稀释，计算得到的样本值差异较大
有时候我们不清楚样本中目的蛋白的浓度如何，应该如何稀释，那么我们就会做下预实验，确定稀释倍数。然而有时候同一样本做了几个不同梯度稀释后，计算得到的样本值之间差异较大，应该选择哪一个稀释倍数呢？
这里涉及到了基质效应。通常血清样本加样量较高时，血清中的各种蛋白会抑制抗原抗体的接触，基质效应较明显。而经过稀释后，干扰因素也随之稀释，影响就会较小。当某两个梯度稀释后，计算得到的样本值接近时，我们就可以认为在该稀释梯度时，样本中的干扰因素影响较小，计算得到的值也是接近真实的。然而这样的稀释是针对目的蛋白浓度较高的样本而言。对于浓度很低的样本，经过多倍稀释后，就更加测不到了，此时可按照厂家说明书推荐的加样方式操作。
Q7.不同试剂盒中的组分能否通用
除非是公用的试剂如洗液、检测缓冲液，其它组分不建议用其它试剂盒的组分，甚至是同一指标不同批次的试剂盒里的组分。这些组分(包括标准品、标准品稀释液、检测抗体、酶等)都是经过优化的，如果贸然使用其它试剂盒的组分，有可能对结果产生影响。



原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/33025410