分子克隆——拓扑异构酶（TOPO）克隆

乔帮主

基于拓扑异构酶（Toposiomerase）的克隆（TOPO cloning）是一种不利用限制酶和连接酶的DNA克隆方法，该技术依赖于A和T碱基的互补配对。本文关注于粘性末端的TOPO（也称为TOPO-TA）克隆，但其实TOPO克隆也可以用于平头末端克隆。
拓扑异构酶是存在于细胞核内的一类酶，他们能够催化DNA链的断裂和结合，从而控制DNA的拓扑结构，拓扑异构酶参与了超螺旋结构模版的调节。

01TOPO克隆的作用机制
如下图所示，PCR产物的“A”突出末端是使用Taq酶扩增得到的，因为Taq聚合酶可在PCR产物3'末端留下了一个脱氧腺苷酸；质粒上互补的“T”来自于拓扑异构酶I线性化的骨架。DNA拓扑异构酶I（绿云）通过切割并重新连接超螺旋DNA末端，同时起了限制性内切酶和连接酶的作用，可在2-5min内完成TOPO克隆反应。
TOPO技术使用了牛痘病毒中分离出的拓扑异构酶I，识别DNA序列5'-(C/T)CCTT-3'并在此序列上酶切双链DNA。DNA断裂释放的能量储存在其 3'末端和拓扑异构酶I上的酪氨酸残基之间的共价键中。

目前市场上的TOPO试剂盒为载体或克隆臂提供了能与拓扑异构酶共价连接的3'脱氧胸腺嘧啶核苷残基（T）突出末端。这些试剂盒中的载体在 -半乳糖苷酶盒中插入了拓扑异构酶识别位点，允许转化后使用蓝白斑筛选——载体末端自连接导致产生蓝色菌落，所以蓝色菌落并非阳性菌落。一旦引入3'突出末端含“A”的插入片段，TOPO克隆便起了作用。




上为粘性末端TOPO克隆，下为平头末端TOPO克隆

02基本过程
下面分解TOPO克隆步骤：
合成PCR产物：设计标准的引物（不需要在末端添加独特的限制酶位点），用Taq聚合酶扩增目的序列。
配置TOPO克隆反应体系：混合PCR产物和TOPO载体。
室温下孵育5min：如果反应完立刻要用于转化则可以先放置于冰上；也可在-20℃过夜储存。
转化：可以用常用的转化方法，但是冰上孵育时间应减少到5min（孵育30min不会显著提高转化效率）。
单克隆鉴定：挑取10个白色或亮蓝色菌落，通过PCR、酶切、测序分析以证实插入片段的存在。

03实验要点
不要在PCR引物上添加5'磷酸，需要的是自由羟基基团。
PCR最后一次循环后，需要增加延伸时间以确保“A”添加到所有PCR产物上。
使用Taq酶扩增存在1/3500的错误率，而使用具有校对功能的聚合酶代替Taq酶可降低错误率，但是校对聚合酶也会移除PCR产物中所有不配对的3'末端。如果想要降低错误率，请使用以下方法之一以确保PCR产物的3'末端“A”保留。
1、使用校对酶和Taq酶的混合物，其中Taq酶和校对酶的比例应该超过10:1。
2、Gel纯化PCR产物后，将其与缓冲液、Taq酶和dATP在72℃下孵育10-15min。
当混合PCR产物和TOPO载体时，需要添加额外的盐到反应体系中：
当PCR产物和载体连接后，拓扑异构酶I从载体上释放；然而，它还有可能重新结合并切割新连接的DNA。盐可以阻止拓扑异构酶I重新结合，保证有更多完整的分子（注意：加入盐的量取决于转化方法，在电转过程中，过量的盐会引起电弧，从而导致电转失败）。
室温下孵育时，不建议超过5min（孵育时间越长，转化效率越低）；但是如果PCR产物浓度过低或者插入片段过大，还是需要孵育20-30min。
因为连接反应较快，所以实验前要做好一切准备。
先预热有抗平板再涂转化菌，可能在8h内长出菌落。

参考书籍：Plasmids 101：A  Desktop resource —— Created and Compiled by Addgene March 2017（3rd Edition）

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