想问一下，实验室提取高纯度DNA的方法有哪些？具体操作又是什么？注意事项有什么？

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想问一下，实验室提取高纯度DNA的方法有哪些？具体操作又是什么？注意事项有什么？
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同花顺

RNA/DNA提取过程中的注意事项

1.避免污染
为避免RNase/DNase等污染，可以在操作前仔细清洁实验平台、试剂盒、器皿和工具等，并使用经RNase/DNase清洗的试剂和器皿。此外，应该尽可能快地进行样品提取，以减少RNA/DNA降解和污染的可能性。

2.明确目的和选择合适的方法
RNA和DNA在分子结构和物理化学特性上有所不同，并且不同的样本类型也有不同的组织结构和特征，因此需要根据实验目的和样本类型选择合适的RNA/DNA提取方法。例如，在提取RNA时，需要更加注意RNase的污染问题；而在提取DNA时，则需要更加注意DNA的不断降解问题。

3.优化样品破碎步骤
样品破碎对RNA/DNA提取至关重要。不同样品类型需要不同的破碎方法，如高压均质机、超声波等。在破碎过程中，需要注意破碎时间和功率控制，以避免过度破碎导致RNA/DNA的降解。
细胞破碎方法：超声波法、高压均质法、玻璃珠法等都是常用的细胞破碎方法。

4.RNA/DNA的纯化和浓缩
在提取和纯化RNA/DNA过程中，需要去除可能存在的污染物，如蛋白质、盐等，并尽可能地减少DNA和RNA的降解。此外，在进行RNA/DNA浓缩时，应根据实验要求选择合适的方法，如酚/氯仿法或柱层析法等。

5.对提取的RNA/DNA进行检测和评估
在提取RNA/DNA之后，需要对其进行确定性和质量评估。可以使用分光光度计和凝胶电泳等技术来测定RNA/DNA的浓度和质量，并评估是否存在RNase/DNase污染等问题。

6.RNase/DNase污染：
RNase或DNase的污染很容易导致RNA/DNA降解，因此需要使用经RNase/DNase清洗的器皿和试剂，并在操作中避免污染。

7.温度控制：
RNA/DNA在高温下易于分解，因此在提取RNA/DNA时要控制好温度。在冷冻样品之前，通常建议在低温环境中培养细胞或收集组织，以最大程度地保护RNA/DNA。

8.RNA/DNA保存：
RNA/DNA应该储存在-80℃冰箱中，以避免降解和污染。在长期储存之前，建议进行浓缩，并将RNA/DNA用RNase-free水稀释至合适的浓度。

9.质检：
在提取RNA/DNA之后，需要对其进行确定性和质量评估。可以使用分光光度计来测定RNA/DNA的浓度和质量，或者使用凝胶电泳来确认RNA/DNA的大小和纯度.


RNA/DNA提取的常见问题及解决方法：

1.RNA/DNA浓度低：
如果提取得到的RNA/DNA浓度较低，则可以通过浓缩RNA/DNA溶液或在提取过程中增加样品量来提高RNA/DNA的浓度。

2.RNA/DNA质量不佳：
如果RNA/DNA分离后质量不佳，则可能是由于RNase/DNase污染、过度破碎、过度处理等原因导致的。需要仔细检查每个步骤，并采取相应的措施来避免这些问题。

3.提取RNA或DNA有选择性：
有时，RNA或DNA的提取会出现选择性问题，即只能提取其中一种。这通常是由于使用的试剂或条件不适合同时提取RNA和DNA所导致的。可以尝试更换试剂或优化条件，以获得更好的RNA/DNA提取结果。

4.样品残留：
在提取RNA/DNA时，倒掉废液后可能会有样品残留在管子或器皿中。这可能会导致RNA/DNA的污染和降解，因此需要特别小心地清洁所有器皿和工具，确保没有任何残留物。

总之，在进行RNA/DNA提取时需要注意许多方面，并且可能会遇到一些问题。如果出现问题，需要仔细检查每个步骤并逐步解决问题，以确保最终得到高质量的RNA/DNA样本。


动物组织样本DNA提取步骤
1.动物组织DNA提取准备
① 材料：动物组织
② 试剂：TIANGEN血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，无水乙醇等
③ 设备：离心机，微量移液器等

2.动物组织DNA提取步骤
① 处理材料：取动物组织10mg，尽量切碎，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。
② 加入20μl蛋白酶K溶液，混匀后56℃水浴，直至组织溶解（不同组织裂解时间不同，通常需1-3小时即可完成）。简短离心以去除管盖内壁的水珠，再进行下一步骤。
③ 加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁水珠。（溶解DNA）
注意：加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般70℃放置时会消失，不会影响后续实验。如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不纯。
④ 加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。（沉淀DNA）
⑤ 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中，吸附柱放入收集管中，12,000rpm（～13,400×g）离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。（吸附沉淀）
⑥ 向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD（使用前先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm（～13,400×g）离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
⑦ 向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW（使用前先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm（～13,400×g）离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
⑧ 向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12,000rpm（～13,400×g）离心30s，倒掉废液。（6、7、8为漂洗）
⑨ 将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm（～13,400×g）离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。（注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的PCR等实验）
⑩ 将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm（～13,400×g）离心2min，将溶液收集到离心管中。（溶解洗脱DNA）（注意：采用硅基质膜吸附的DNA，可将DNA在低盐高pH值条件下洗脱下来。pH值在7.0-8.5之间洗脱效率较高，pH值低于7.0则洗脱效率很低）
洗脱缓冲液体积不应该少于50μl，体积过小影响回收效率。为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12,000rpm（～13,400×g）离心2min。DNA产物应保存在-20℃，以防止DNA降解。


植物组织样本DNA提取步骤

1.植物组织DNA提取仪器与设计准备
实验仪器：高速离心机；烘箱；冰箱；水浴锅；高压灭菌锅；Nanodrop。
实验试剂：玻璃珠，十二烷基磺酸钠(SDS)；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；乙二胺四乙酸
（EDTA）；氯化钠；苯酚；氯仿；无水乙醇等。

2.植物组织DNA提取步骤
植物组织的DNA提取通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。

详细操作步骤如下：
① SDS提取缓冲液在65℃水浴中预热。
② 将叶片置于1.5ml离心管中，液氮速冻，组织研磨器打样。
③ 加入700ml的SDS提取缓冲液，涡旋摇匀。
④ 置于65℃的水浴中，每隔10min轻轻摇动，30min后取出。
⑤ 加入200mlKAc溶液，摇匀，放入-20℃冰箱30min。
⑥ 10000rpm离心5min，上清移至新离心管中，12000rpm离心5min。
⑦ 上清移至新离心管中，加入700ml异丙醇，-20℃冰箱30min。
⑧ 10000rpm离心5min，弃上清，加入500ml70%乙醇漂洗。
⑨ 弃液体，晾干。
⑩ DNA纯度与浓度测定（使用nanodrop）。

DNA纯度：DNA的OD260/OD280一般为1.8左右。
OD260/OD280»1.8：说明较纯；
OD260/OD280>1.8：说明可能有RNA污染；
OD260/OD280<1.8：说明可能有蛋白质污染。

3.植物组织DNA提取注意
① 叶片磨得越细越好。
② 注意移液器的正确使用。
③ 由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。

4.RNA提取注意事项
① 组织样本要尽可能的新鲜，避免反复冻融。
② 提取时组织要充分研磨，组织量不宜过少，更不宜过多。
③ 加入裂解液后应给予充分的孵育时间，使样本充分裂解。
④ 在用Trizol法提取时，分层后吸取上清的原则是“宁愿少吸，不能多吸”，千万不能提取到中间层，否则会导致严重的基因组DNA污染。
⑤ 洗涤时洗涤液应充分浸润到管壁的四周，确保洗涤彻底。
⑥ 柱式提取法，洗涤完后除了对柱子进行空离后，还应当将吸附柱置于超净台内吹风5~10 min，使有机溶剂充分挥发干。
⑦ 柱式法最后洗脱时候，当加入DEPC水后还应孵育3~5 min，或者提前将DEPC水加热至60℃，可提高洗脱得率。传统的Trizol裂解异丙醇沉淀法最后RNA是用DEPC水溶解沉淀，则应当给予适当溶解时间，并用枪头不断吹吸离心管底部。


其他原因及解决办法
1.获得RNA效率低有一下原因
① 样品裂解或匀浆处理不彻底
② 最后得到地RNA沉淀未完全溶解

2.A260/A280＜1.65原因
① 检测吸光度时，RNA样品不是溶于TE，而是溶于水。低离子浓度和低PH条件下，A280值会较高
② 样品匀浆时加地试剂量太少
③ 匀浆后样品未在室温放置2分钟
④ 水相中混有有机相
⑤ 最后得到地RNA沉淀未完全溶解

3.RNA降解原因
① 组织取出后没有马上处理或冷冻
② 样品或提取地RNA沉淀保存于-5--20度，未在-60--70度保存
③ 细胞在胰酶处理时被破坏
④ 溶液或离心管未经RBase去处理

4.预防RNase污染，应注意以下几个方面
① 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。
② 使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。
③  RNA在Trizol试剂中不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150 ℃烘烤4h，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10min，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
④ 配制溶液应使用无RNase的水（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至中浓度0.1%(v/v)，放置过夜，高压灭菌。注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作）。

感恩由您

   分子生物中RNA 和 DNA 提取会常常遇到一些问题，下面小编就RNA 和 DNA 提取实验中的通常遇到的几个问题进行解析。

1.提取产量低
  如果您遇到的 DNA/RNA 产量低于您对样品的预期，则需要考虑许多因素。通常，这是一个裂解问题。不完全裂解是产量低的主要原因。它也可能是由不正确的绑定条件引起的。确保使用新鲜的优质乙醇（100% 200 标准）稀释缓冲液或添加到结合的步骤。劣质乙醇或旧库存可能已经吸收了水分，并且浓度不正确。如果洗涤缓冲液制备不正确，您可能正在洗掉提取的 DNA 或 RNA。
2.提取低纯度
如果提取的 DNA 被蛋白质污染（低 260/280），那么您可能开始时样品过多，而蛋白质没有完全去除或溶解。
  如果 DNA 的 260/230 比率不佳，则问题通常是结合或洗涤缓冲液中的盐分。确保使用最高质量的乙醇来制备洗涤缓冲液，如果问题仍然存在，请再次洗涤色谱柱。
与其他样品相比，一些样品含有更多的抑制剂。环境样品特别容易出现纯度问题，因为腐殖质在提取过程中会被溶解。
腐殖质的行为与 DNA 相似，很难从硅胶柱中去除。
3.DNA或RNA降解
  降解是RNA制备中常常到的问题。因为在 RNA 提取过程中，样品储存不当或裂解效率低等情况都会导致降解。对于 DNA 提取，降解不是一个大问题，因为对于 PCR，DNA 可以被剪切并且工作正常，如果不希望有较多剪切的 DNA，可以使用弱裂解的方法。

PCR 净化时的注意事项

   PCR 净化其实并不是 DNA 提取技术本身，但它是一种效率高且简单的技术，它只是添加高浓度的结合盐（通常每体积 PCR 反应 3-5 体积盐）和离心来过滤。
在实验过程中，PCR Clean-up 试剂盒出现故障也会导致整个实验功亏一篑。
     因为在PCR 反应中有较多吸收 260 度紫外线的物质，比如：核苷酸、去污剂、盐和引物。所以，PCR 净化试剂盒经常无法正常工作可能是由于 PCR 反应失败所造一般成较难清理。
      苏州阿尔法生物14年专注于科研仪器、实验室仪器供应，提供实验室仪器包括生物反应器、震荡培养箱、二氧化碳培养箱、瑞宁移液器、荧光定量PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像仪、流式细胞仪、粒径分析仪等。
科研仪器采购-PCR试剂盒-PCR耗材-苏州阿尔法生物

大力水手

今天给大家分享一下DNA提取技术干货，目前主流的几款血浆游离DNA提取试剂，现在液体活检已经成为医学检验的一个趋势，而各种疾病筛查成为现在研究的热点。接下来大家就跟小编一起来了解一下吧。



血浆DNA与血浆游离DNA提取试剂的选择方法

血浆DNA，又称血液循环DNA、游离DNA，是指血液中游离于细胞外的DNA，其来源主要有三：白细胞崩解释放的DNA、坏死组织特别是肿瘤组织释放入血液的DNA和感染病毒、细菌的DNA。

近几年来，随着基因诊断技术的发展，游离DNA的应用价值越来越大，如优生筛查、肿瘤早期诊断、遗传病检测和病原体感染基因检测等。但血液中游离DNA含量一般较低，片段较小，不易提取，这大大影响了游离核酸的基因检测和各种研究的开展。

游离DNA提取方法一般有TRizol方法、离心柱法、磁珠法。其中，Trizol方法与离心柱相比，提取效果相当，但是因其对操作者带来的毒性，现在越来越被弃用。磁珠法比较适合机器自动化提取，如果没有核酸提取仪，只是使用磁力架配套提取，磁珠法的操作就比较麻烦且容易导致样本交叉污染。另外，根据研究，磁珠法的核酸提取得率不如离心柱法。如果要提取的游离核酸的量比较低，最好选择离心柱法。对于游离DNA含量较低的样本或比较珍贵的样本或样本总数不是很多的实验室，首选的核酸提取方法应是离心柱法。

离心柱法游离DNA提取原理主要是样本裂解后，游离DNA在高盐条件下与硅胶膜结合，再在低盐、高PH值时将DNA从硅胶膜上洗脱下来。面对各种品牌的离心柱法提取试剂盒，哪种才是最适合的呢？目前国内常用的离心柱法游离DNA提取试剂盒有国内品牌Biog、国际品牌Q、国内品牌T等。我们以下就几种游离DNA提取试剂盒进行比较。



一、有较高的提取得率。

DNA核酸提取得率的确定，常用的是使用紫外分光光度计的方法。但是，血清、血浆dna样本中游离核酸含量较低，如果直接用紫外法检测，得出的数值并不准确，而且多次测量的结果会变异很大。关于提取得率，Qiagen的研究数据是1ml正常血浆样本cfDNA得为7.35ng左右，但如果白细胞大量凋亡，血浆中的游离DNA量会有所增加，肿瘤病人的血浆DNA会大幅增加。

有些研究者提取血浆DNA后习惯于先用紫外检测浓度，发现紫外检测不出来或浓度很低时便认为提取失败，放弃后面进一步的实验，其实并不可取。我们可以把紫外读数作为参考，但是不能作为判断得率的唯一标准，最好还是要做个PCR或荧光定量。

根据Qiagen公司的实验，血清血浆的量与DNA提取的核酸量成正比。因而，如果要提高核酸得率，可通过增加血清或血浆的量来实现。一般地，做血浆或血清核酸提取，样本量最好在1ml以上。如果1ml或更大量样本得不到满意的检测结果，则应及时考虑更换提取试剂盒。

目前国内常用的DNA提取提取试剂有国际品牌Q、国内品牌T、国产品牌Biog等，我们实验室使用下来，Biog的核酸提取得率较高，1ml肺癌病人血浆DNA得率在85ng左右，Q的得率在72ng左右，T的得率在63ng左右，基本上都能满足下游PCR实验的需求。当然，如此低的浓度直接测OD值不太容易，如果使用Nanodrop2000c，其检测下限为2ng/ul。如洗脱液为30ul，则需要1ml左右的血浆才能检测出来。显然，如果是健康人的血浆，1ml血浆的DNA浓度更低，紫外可能根本就检测不出来。因而，血浆DNA提取完成以后，最好直接做PCR，紫外检测的意义不大。

二、提取的核酸纯度高。

核酸纯度一般根据OD260/OD280比值来判断。一般说来，试剂盒DNA提取的DNA 其OD260/OD280比值应在1.6--1.8之间。如果提取的DNA溶液OD260/OD280比值小于1.6，通常说明有蛋白质或酚、多糖等的污染。如果提取的DNA溶液OD260/OD280>1.9,则表明有RNA污染。

使用Q公司血浆DNA提取试剂盒提取的血浆DNA, OD260/OD280一般在1.7-1.9之间；使用Biog血浆游离DNA提取试剂盒提取的血浆DNA, OD260/OD280一般在1.6-1.9之间，使用T公司血浆DNA提取试剂盒提取的血浆DNA OD260/OD280比值也在1.6-1.9之间。Q公司提取DNA的纯度似乎优于国产试剂，但我们提取的DNA是用于PCR检测，结果并无明显影响。可能因为Biog公司血浆游离DNA提取试剂盒提取的血浆DNA得率较高的原因，同样的DNA加样体积（2ul），Biog试剂盒提取的DNA 荧光定量PCR检测结果CT值要优于Q公司试剂盒提取的DNA。

三、操作简便性。

操作简便性也是血浆DNA提取试剂选择的一个重要因素。操作过于复杂，不仅费时费力，还容易导致样本间的交叉污染，也容易损失样本。特别是用于临床检测或样本较多情况下的检测，操作复杂如果导致交叉污染会引起误诊，还会影响出检测报告的时间。因而，选用操作简便、流畅的提取试剂盒非常重要。

就我们曾经用过的以上三种提取试剂盒来说，Q公司的血浆DNA提取试剂盒提取过程大约30min，从样本处理开始需要个10步骤； T公司血清/血浆游离DNA提取试剂盒整个提取过程需要约40min，从样本开始处理10个步骤；B公司的Biog血浆游离DNA提取试剂盒提取过程大约25min，从样本开始处理8个步骤，Biog公司的血浆游离DNA提取试剂盒在操作简便性上具有一定优势，更适合于较多样本的检测。据了解，该产品已通过药监局备案，也更适合临床样本的检测。

综合看来，与国外知名品牌相比，国产试剂盒在血浆DNA提取纯度上稍有不足，但在提取得率和操作简便性上基本没有区别，有些品牌还略有优势，可根据实验需求进行选择。对纯度要求较高的实验，可选择Q等国外知名品牌，如果对提取量要求较高或提取后主要进行PCR或分子杂交之类的实验，可考虑选择Biog等国产品牌。
<hr/>文章摘自：搜狐网
原作者：优易信网络

大力水手

简单说一下三种方法
1.浓盐法
利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离。
1）用1M 氯化钠提取，得到的DNP粘液；
2) 与含有少量辛醇的氯仿（科邦实验室提供）一起摇荡，使乳化；
3) 离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中；
4) 用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来。
2.阴离子去污剂法
用SDS或二甲苯酸钠（科邦实验室提供）等去污剂使蛋白质变性, 可以直接从生物材料中提取DNA。 由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合, 而阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA。
3.苯酚抽提法
材料：冷冻或新鲜猪肝组织 设备：EP管、微量取液器(20μl， 200μl，1000μl)， 台式高速离心机， 涡旋振荡器（科邦实验室提供）；
操作步骤：
1）样品预处理 取新鲜动物组织25-50 mg（组织量不宜过多，否则容易导致裂解不完全而堵塞离心柱），组织剪碎或者切成小块放入研钵研磨捣碎。
2）加入600 μl 的Lysis Buffer，颠倒充分混匀。如需消化RNA，可加入20 μl RNase A，颠倒混匀，室温放置5 min。
3）加入10 μl Proteinase K，混匀。56℃水浴45 min-1 h，其间颠倒混匀数次直到看到组织完全裂解，裂解完全的标准为液体变得清亮及粘稠。（此步骤可以过夜处理）
4）12,000 rpm 离心10 min，将上清转入新的离心管中，加入800 μl 无水乙醇，混匀。
5）将液体转入离心柱（一次加不完，可分次转入），12,000 rpm 离心1min，弃废液。
6） 加入700 μl Wash buffer A（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm 离心30 s -1 min，弃废液。
7）加入700 μl Wash buffer B（使用前请先检查是否已加入无水乙醇）， 12,000 rpm 离心30 s -1 min，弃废液。
8）加入500 μl Wash buffer B，12,000 rpm 离心30 s-1 min，弃废液。
9）再次12,000 rpm 离心2 min，将离心柱置于新的离心管中，并打开离心柱盖，于室温或37℃恒温箱放置5~10 min，直至无明显乙醇味。
10）在硅基质膜中央加入50-200 μl TE buffer(事先预热55-65℃)，置于室温2-5 min，12,000rpm 离心30 s。
11）离心得到的溶液再次加入离心柱中，室温放置2min， 12,000 rpm 离心2 min。所得的溶液为纯化后的基因组DNA。

同花顺

额，说实话，现在实验室里都是用买来的试剂盒来提取DNA，按照说明书的方法来提，注意事项也写好了。
给你贴一个国产试剂盒的说明书：