ELISA实验如何准确的稀释样本方法

临床医师

一个准确的ELISA检测实验，必须包含三大要素：性能可靠的试剂盒、造模成功并准确采集的样本、可控环境且严谨实验操作，三者缺一不可。在操作过程中，经常遇到样本稀释问题，需要进行样本稀释。
一、在ELISA实验过程中，超过试剂盒检测范围的，一般有这几种情况。
     样本值高的可能情况:
1、样本中待测物含量过高。一些高丰度蛋白来说，比如免疫球蛋白、脂联素、C肽、载脂蛋白等，在样本中本身含量就很高，有的达到mg/mL浓度。
2、一些受诱导表达的细胞上清中，大量表达，比如小鼠细胞诱导后，大量表达肿瘤坏死因子α（TNFα），小鼠胰岛细胞受诱导后，大量表达胰岛素（INS）。
3、在一些感染性疾病中，大量表达，比如乙肝表面抗原、C反应蛋白。
4、疫苗原性研究时，注射疫苗的小鼠，会产生大量针对疫苗的抗体。
5、一些被浓缩的样品，比如重组蛋白的产物，单克隆抗体纯品等。
  二.在ELISA检测过程中，经常会遇到这样的问题：样本测定OD值超过标曲最高点OD值，造成测定数据无法直接使用。样本必须进行稀释，如何确定测定样本的稀释倍数？咱们先了解下    样本稀释容易犯的错误有哪些？
1、稀释不足。稀释倍数不足时，容易导致最终结果偏小。
2、过度稀释。过度稀释时，容易导致最终结果偏大。
3、稀释不够规范，引入很多人为偏差。稀释不够规范，特别是大比例稀释时，人为偏差大大增加。
三、如何确定测定样本的稀释倍数呢？样本稀释的原则如下：
在查询背景知识，或者通过预实验，确认了样本浓度过高，需要进行稀释，就要根据以下原则，严谨操作和计算。
1、稀释倍数合理。稀释后样本测定的OD值，要求落在标准品最高值OD值的半量程内，假定标准品最高值的OD值是2.4，那么稀释后的样本，OD值接近1.2，在这个范围附近，计算的浓度值最为准确，以这个结果乘以稀释倍数，得到的样本浓度最准确。
2、稀释过程规范。特别是大倍比的稀释，最好是梯度稀释。比如样本要稀释200倍，就先稀释10倍，再在10倍稀释的基础上，再进行稀释20倍，得到200倍。
3、样本取样量不要太小。在样本充足的情况下，样本取样量不要低于5uL，越低的取样量，在混匀取样过程中，误差越大。
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