ELISA的原理和使用案例

风云

酶联免疫吸附测定（ELISA）概述


ELISA测定法通常在96孔板中进行。这些板被设计成通常通过直接吸附到微量滴定板的表面上或间接地通过预先包被的抗体间接地结合和固定抗原。固定后，将一抗引入样品中，与抗原形成免疫复合物。一抗可以共价标记到酶（例如HRP）上，或者如果一抗被生物素标记，则一抗本身可以使用酶标记的二级抗体或链霉亲和素偶联物间接检测。通过与合适的底物孵育来评估共轭酶的活性，从而实现检测，该底物会产生可测量的副产物。试剂盒在灵敏度和成像设备的兼容性方面各不相同。

直接与间接检测


在ELISA中检测一级抗体-抗原复合物的方法可以是直接的或间接的（图1）。在直接检测方法中，与报告酶（例如HRP或AP）缀合的单一一抗可以直接检测靶抗原。通过间接检测，可以依次使用双抗体系统检测目标靶标。首先，将样品与针对目标抗原的未标记一抗孵育。然后，使用一抗特异的酶标二抗检测其存在，从而检测靶抗原。如果使用生物素化的一抗检测抗原，则使用酶标记的抗生蛋白链菌素偶联物作为您的第二检测试剂。

使用哪种检测方法取决于靶抗原的表达水平。为了检测高度表达的抗原，直接检测是合适的方法。当灵敏度至关重要时，例如检测低丰度靶标或表达不良的抗原，请使用间接检测方法来增强信号。
ELISA的原理（间接法）

酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种基于抗原-抗体特异性结合的高灵敏度检测方法。它通常用于检测蛋白质、抗体或其他分子，原理如下：

• 抗体固定: 将特异性抗体预包被在酶标板的孔中，这些抗体能够特异性识别目标分子（如IL-10）。
  
• 抗原结合: 样品或标准品中的目标分子（抗原）与包被的抗体结合。
  
• 加生物素标记抗体: 用生物素标记的二抗与抗原的不同位点结合，形成夹心复合物。
  
• 加HRP标记的亲和素: HRP标记的亲和素通过与生物素的高亲和力结合到复合物上。
  
• 显色反应: 加入底物溶液（如TMB溶液），HRP催化底物产生颜色反应，颜色深浅与样品中目标分子含量成正比。
  
• 终止反应并检测: 终止溶液停止颜色反应，使用酶标仪测定吸光度（OD值），从而推算出样品中目标分子的浓度。
  

生物素（Biotin）

• 性质: 生物素是一种小分子维生素（维生素B7），具有极高的与亲和素结合的特异性和亲和力。
  
• 用途: 在ELISA中，生物素标记在抗体上，便于与HRP标记的亲和素结合，形成放大信号的复合物。
  

辣根过氧化物酶（HRP）

• 性质: HRP是一种从辣根中提取的酶，能够催化多种底物产生可测量的颜色或发光反应。
  
• 用途: HRP通过与生物素结合的亲和素附着在复合物上，在加入底物后催化反应，产生信号。
  

底物溶液（Substrate Solution）

• 成分: ELISA中常用的底物溶液为TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺），一种无色液体，HRP催化后会变为蓝色。
  
• 用途: TMB显色的强度与酶活性相关，而酶活性与样品中目标分子的浓度成正比。
  

直接法和间接法

它们之间的关系

• 抗原-抗体反应: 抗体与目标分子（抗原）结合，形成基础的特异性检测。
  
• 生物素-亲和素放大系统: 生物素标记抗体结合抗原后，HRP标记的亲和素与生物素结合，进一步增强信号。
  
• HRP催化底物显色: HRP通过催化TMB底物产生颜色变化，提供了与目标分子浓度成正比的检测信号。
  
• 显色信号检测: 通过酶标仪测量吸光度，计算目标分子的浓度。
  

这套系统通过生物素-亲和素的高亲和力结合和HRP的高效催化作用，大幅提高了检测灵敏度和信号强度，使ELISA成为一种高灵敏、高特异的检测技术。
<hr/>举个例子：
人白介素10 (IL-10) ELISA试剂盒

目录号: CSB-E04593h
用途: 用于定量测定血清、血浆和组织匀浆中的人白介素10 (IL-10)浓度。
检测原理

本试剂盒采用定量夹心酶联免疫法。

• 步骤：
  

• 预包被特异性抗IL-10抗体的微孔板中加入标准品和样品，IL-10被固定抗体捕获。
  
• 移除未结合物质后，加入生物素标记的抗IL-10抗体，与IL-10结合。
  
• 再次洗涤后，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的亲和素，与生物素结合。
  
• 通过洗涤去除未结合的酶试剂后，加入底物溶液，产生与IL-10浓度成比例的颜色反应。
  
• 停止反应并测量颜色强度。
  

检测范围

31.25 pg/ml - 2000 pg/ml
灵敏度

最小可检测浓度：小于7.8 pg/ml。
灵敏度定义为零标准品20次测定的平均光密度值加3倍标准偏差的最低蛋白浓度。
特异性

本试剂盒具有较高的灵敏度和特异性，检测过程中未发现人IL-10与类似物之间的显著交叉反应或干扰。
注意: 由于技术及知识的限制，无法完全检测所有类似物，可能仍存在交叉反应。
精密度

• 板内精密度（同一板内）: CV%<8%
  三个已知浓度样品在同一板中测定20次。
  
• 板间精密度（不同板间）: CV%<10%
  三个已知浓度样品在不同板中测定20次
  

操作局限性

• 仅限研究用途，不得用于诊断程序。
  
• 不得使用超过试剂盒标签上有效期的试剂盒。
  
• 不得混用不同批次或来源的试剂。
  
• 如果样品浓度超过最高标准值，需用样品稀释液稀释后重新检测。
  
• 样品稀释液、操作人员、移液技术、洗涤技术、孵育时间或温度、试剂盒有效期的变化，均可能导致结合差异。
  
• 虽然设计时尽量消除可溶性受体、结合蛋白及生物样品中其他因子的干扰，但未测试所有可能的干扰因素，无法排除干扰的可能性。
  

储存条件

• 未开封试剂盒: 2 - 8°C储存，勿使用超过有效期的试剂盒。
  
• 已开封试剂盒:
  
  
  
  • 酶标板: 可在2 - 8°C条件下保存1个月，建议密封保存，避免受潮。
    
  • 标准品: 可在2 - 8°C条件下保存1个月，长期保存建议-20°C。
    
  • 其他试剂: 生物素抗体、HRP-亲和素及其稀释液、样品稀释液、洗涤液、TMB底物、终止液均可在2 - 8°C条件下保存1个月。
    
  
  

需自备材料

• 450 nm微孔板读数仪（校正波长540 nm或570 nm）。
  
• 可提供稳定孵育条件（37°C ± 0.5°C）的孵育箱。
  
• 喷瓶、分液器或自动洗板机。
  
• 吸水纸，用于吸干板。
  
• 100 ml和500 ml量筒。
  
• 去离子水或蒸馏水。
  
• 移液器及枪头。
  
• 用于稀释的试管。
  

注意事项

• 本试剂盒提供的终止液为酸性溶液，使用时需佩戴眼部、手部、面部和衣物保护装备。
  

视频链接

具体操作视频详见链接：ELISA Kit操作视频及标准曲线绘制 -武汉华美生物
<hr/>Elisa 直接法

在直接ELISA中，抗原通过被动吸附直接固定在板的表面，并使用HRP标记的一抗进行检测。将无色底物引入样品，该底物与酶结合物反应，并产生可测量的副产物。根据底物的选择，该副产物可以是比色的，化学发光的或荧光的。信号产生的大小与样品中抗原的数量成正比。在所有ELISA法中，直接ELISA分析最简单，执行最快，但灵敏度最低。



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