干货分享 | 化学感受态细胞进行转化的选择法则

生物科研实验室

细菌转化是受体细菌以低频率从环境中吸收外源DNA的天然过程，经转化后的细菌可表达相应的遗传形状，是遗传多样性的来源之一，也可能为宿主细菌带来额外的好处（如抗生素抗性）。感受态细胞是通过物理或化学方法进行诱导，使其处于最适摄取或容纳外源DNA的生理状态，可高效吸收环境中的DNA分子。感受态细胞常用于分子克隆中，用于复制增殖重组DNA分子。但感受态细胞多种多样，当选择感受态细胞进行转化时，需要考虑多种因素，如转化方式、转化效率、转化通量、感受态细胞的遗传背景等，更重要的是实验研究目标。这些因素会直接影响细菌转化的成功率。

一、转化方式


选择感受态细胞时，转化方式是需要考虑的重要因素之一。转化方式分为热激和电转两种，对应的感受态细胞即为化学感受态细胞和电转感受态细胞。选择哪种转化方式取决于实验所需的转化效率、所转化质粒DNA的类型、数量及复杂度等。
热激和电转两种转化方式各有优劣。热激（化学转化）不需要配套设备，一般实验室均可进行，转化效率能满足日常克隆或亚克隆需求。由于化学感受态细胞是通过阳离子和热激处理使其细胞膜穿透性增强，所以对于某些具有细胞壁的菌株，化学转化则不太适合。



相比较而言，电转的转化效率更高。因此电转可用于不同浓度（从低浓度到饱和浓度）、不同大小、不同复杂度DNA的转化。那些不能制成化学感受态的菌株可以制成电转感受态。但进行电转需要额外的设备，如电转仪和电转杯。此外，针对不同的菌株，可能还需要对电转方案进行优化。
二、转化效率


转化效率可反映出感受态细胞摄取超螺旋质粒的数量，因此转化效率会影响到克隆效率。感受态细胞具有不同的转化效率，受制备方法、所转化DNA类型、存储条件等多种因素的影响。



对于大部分分子克隆实验，106至1010 CFU/µg的转化效率已经足够。对于超螺旋质粒的常规克隆或亚克隆，大约106 CFU/µg级别的转化效率即可满足。对于复杂DNA，如平末端连接产物、短插入片段或微量DNA，需要具有更高转化效率（~108–109 CFU/µg）的感受态细胞。电转感受态细胞（转化效率>1×1010 CFU/µg）则推荐用于最具挑战的细菌转化，如gDNA或cDNA文库构建、>30 kb质粒的转化等。

三、转化通量


要进行的转化反应数量多少也是一个需要考虑的因素。由于需要电转仪和电击杯，且设置自动化流程比较困难，所以电转不太适用于进行高通量分子克隆。



相比之下，使用化学感受态细胞通过热激进行转化可以灵活用于不同的实验通量。对于低通量的细菌转化，单管包装的化学感受态细胞可以直接进行热激，可避免因反复冻融造成的转化效率降低。对于中通量的细菌转化，可选择预装入联管中的感受态细胞，再借助多通道移液器进行转化。对于高通量细菌转化，选择预装入96孔板的感受态细胞，可实现模块化孵育，甚至可兼容自动化。
四、细菌基因型


一个细菌菌株定义为一个细菌种类下面的一个子类，相比亲本野生型具有某些特定的遗传变异。常用于细菌转化的大肠杆菌菌株包括DH5α、BL21、HB101和JM109。每个菌株可通过基因型进行描述，基因型中列出了诸如插入或缺失突变。菌株的基因型在决定其是否适用于特定克隆实验中具有关键作用。

五、研究目标


对于特殊的DNA类型，进行成功转化往往需要不同的转化方法、转化效率以及细菌基因型，因此选择适合的感受态细胞至关重要。这些特殊DNA类型包括：大质粒、DNA文库、含重复序列的不稳定质粒、甲基化DNA、含致死基因载体、表达载体等。



（1）大质粒的克隆

转化效率往往随着质粒大小的增加而降低，因此大质粒（>10 kb）会影响到细菌转化。提高大质粒转化成功率的建议有：

选择具有更高转化效率（>1×109 CFU/μg）的感受态细胞进行10-30 kb质粒的转化。

选择电转而非热激，以获得更高的转化效率。

对于>30 kb的DNA构建体（如cosmids），选择经专门测试过的感受态细胞转化。



（2）不稳定质粒的克隆

某些DNA构建体易发生DNA重组，因此在转化后的细菌细胞中不稳定。此类质粒构建体包括逆转录病毒和慢病毒载体，它们包含长末端重复序列（LTR）、反向重复序列和串联重复序列。

（3）DNA甲基化

一些限制性内切酶已知对甲基化敏感，不能切割甲基化的DNA序列。dam和dcm基因分别编码大肠杆菌中最常见的两种甲基化酶，即DNA腺嘌呤甲基化酶和DNA胞嘧啶甲基化酶。保持DNA未甲基化的常规做法是使用dam和dcm缺陷的感受态细胞进行转化。



（4）含ccdB致死基因载体的增殖

阳性筛选法是进行菌落筛选的方法之一。在此方法中，载体在多克隆位点（MCS）中含有一个致死基因。将插入片段成功克隆到载体中，可破坏致死基因的表达并允许菌落形成。来自F'附加体的ccdB基因是用于阳性筛选的致死基因之一，并在许多克隆载体中用作筛选标记。CcdB蛋白是一种毒素，可干扰DNA促旋酶的重新结合步骤，使宿主染色体片段化并抑制细胞生长。为了增殖具有活性ccdB基因的克隆载体，宿主细胞必须能够抵抗CcdB的毒性作用。



（5）重组蛋白在细菌中的表达

重组蛋白表达中最常用的大肠杆菌菌株是BL21及其衍生菌株。