① 荧光定量PCR 1.定义: 荧光定量PCR( realtimefluorescence quantitative PCR,RTFQ PCR) 是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术,它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度。 2.原理: PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;刚开始时,探针结合在DNA任意一条单链上;PCR扩增时,Taq酶的5’端-3’端外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
② 数字PCR 1.定义: 数字PCR即Digital PCR(dPCR),它是是一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR数字PCR可让你能够直接数出DNA分子的个数,是对起始样品的绝对定量。 2.原理: PCR实际上是一个在模板DNA、引物(模板片段两端的已知序列)和四种脱氧核苷酸等存在的情况下,DNA聚合酶依赖的酶促合成反应,扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合。
③ 高通量测序 1.定义: 高通量测序技术(High-throughput sequencing)又称“下一代”测序技术(“Next-generation” sequencing technology),以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。目前科学界所说的高通量测序还指的是第二代测序。 2.原理: Illumina/SolexaGenome Analyzer测序的基本原理是边合成边测序。在Sanger等测序方法的基础上,通过技术创新,用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP,当DNA聚合酶合成互补链时,每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光,根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理,从而获得待测DNA的序列信息。
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