流式细胞术检测的基本流程、优势及常见案例解答

xiaoqin

流式细胞术检测的对象一般是呈独立状态的悬浮于液体中的细胞，如果要检测组织中的细胞，则必须先将组织制备成单细胞悬液，而后方可进行检测。

制备基本流程如下：

1.细胞的培养、制备将一定数量的单个细胞收集于1.5mL的EP管中，2400rpm、4℃离心4min，弃上清；加入1xPBS清洗，同等条件进行离心，弃上清。

2.封闭用来标记样品细胞的荧光素偶联抗体多为单克隆抗体，少数也可能是多克隆抗体，但其基本结构都是由两部分组成：包含有特异性结合抗原位点的Fab段、相对保守的Fc段。抗体的特异性表现在Fab段，标记时利用Fab段的抗原结合位点与细胞上抗原分子进行特异性结合，从而进行标记并且相对量化的展示了细胞表达该抗原分子的情况。

3.荧光素偶联抗体标记以CD3-APC-Cy7、CD4-FITC为例，一般染色体系推荐100μl，CD3、CD4表达量相对较高，1μl足够了，假如有9个样本，分别取10μlCD3-APC-cy7、CD4-FITC加到含有990μl的1.5ml的EP管中，混匀后，分别取100μl加到9个样品孔中，混匀，室温、避光染色20min。时间到后加1ml FACS buffer洗去未结合的抗体，2400rpm、4°C离心4min，弃上清，加200μl FACS buffer或2%的多聚甲醛重悬沉淀，并尽快上机分析。

4.光电倍增管电压的设定上机分析时，在确认机器没有问题后，需调节每个通道的光电倍增管的电压，从而区分细胞群，利用FSC和SSC，通过调节FSC和SSC的电压，区分淋巴细胞亚群，使样品细胞或者目标细胞位于流式图的中央或者靠近中央的位置。FSC和SSC的电压确定之后还需调节APC-cy7、FITC的电压，使阳性细胞群和阴性细胞群尽可能的分离。

5.设置对照，补偿调节流式实验中对照设置很重要，常见的有阴性对照、FMO对照、补偿单阳管对照。

流式细胞术检测优势：

1、有着强大的分选功能

在分析的同时能够分选特定的群体。

2、可以对很多类别的样品进行检测

各种培养上清、细胞裂解液、微生物、人工合成微球、细胞血清、血浆等。

3、有着较快的检测速度以及较多的分析样本的数量

很多的细胞能够在很短的时间里被分析出来，如果有足够多的样品种的细胞，那么几万个细胞，甚至几百万个细胞也能够在几分钟类被流式细胞仪检测出来。

4、单个细胞的多个特点可以被同时分析

细胞通过使用荧光染料或者不同荧光素标记的单克隆抗体来进行多色染色，通过流式细胞分析，可以使单细胞的多个信息得到，能够更加准确地识别和统计细胞亚群。

三 流式案例解答

1. 横轴纵轴怎么确定呀？直方图横轴代表通道的荧光或散射光的强度，可以是对数或线性的，纵轴代表细胞数。散点图横轴和纵轴都代表通道的荧光或散射光的强度。

2. 请问流式能用来检测两种细胞的相互作用吗？流式一般检测单个细胞，所以直接检测两种细胞的相互作用不是很适用。但是可以考虑使用流式检测两种细胞上相互作用的分子，或者检测相互作用后效应分子的表达情况来间接反映两种细胞的相互作用。

3. 可以通过效应T细胞/记忆T细胞来判断细胞亚群吗？可以，选择合适的效应T细胞/记忆细胞marker。例如常用CD45RA和CD45RO来区分人的初始T细胞和记忆细胞亚群，也可以配合其他一些marker，如CCR7、CD62L、CD27、CD28、CD127、CD95、CD103来区分初始T细胞、不同的记忆T细胞和终末效应T细胞亚群。

4. Marker怎么选，怎么知道细胞表达的maker情况？最主要是参考文献中的信息，我们公司也提供了一些常用细胞的marker信息可供参考。

5. 在做ROS实验时，首先阴性对照加探针组别阳性率就比较高，有什么方法可以解决吗？这个最好是结合空白组、实验组或者给药组的结果一起分析，可能涉及的原因包括细胞状态不好、残余探针未洗净、电压设置过高等。

6. 凋亡的象限如何划分？使用Annexin V和PI凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡时，左下的象限（双阴性区域）是正常的活细胞，Annexin V单阳区域是早期凋亡细胞，双阳区域是晚期凋亡细胞，PI单阳区域主要是坏死细胞或碎片。

7. 细胞焦亡可以通过流式检测吗可以通过检测焦亡相关蛋白，比如caspase蛋白来反映细胞焦亡。

8. 流式和ELISA测细胞因子，怎么选择？检测胞内的细胞因子建议选流式，流式不仅可以用来检测胞内的细胞因子，还可以进行多参数的同时检测表面蛋白或功能蛋白。检测分泌到细胞外的细胞因子可以用ELISA。

9. 老师，破膜的细胞是不是已经死了？破膜固定的细胞，是不是就不需要染死活了？是的，固定破膜处理后的细胞是死了。对于需要固定破膜的样品，可以选择能适用于固定破膜样品的死活染料，譬如与蛋白质胺基结合的死活染料来区分死/活细胞。

10. Te和Tm的比值变化代表细胞的分化程度？（比如幼稚细胞和年老细胞的数量变化）Te和Tm比值变化可以反映细胞中效应细胞和记忆细胞的比例关系。初始T细胞在接受抗原刺激后分化为效应T细胞和记忆T细胞，但是效应T细胞与记忆T细胞的分化路径目前有不同的理论模型，尚在研究中。

11. 有关分选性流式使用没有具体讲解吗？本次讲座没有具体讲解分选性流式。分选性流式需要使用具有分选功能的流式细胞仪，同时需要操作人员有一定的流式细胞分选的基础。在准备细胞的过程中需要注意保持无菌和维持细胞活性。分选过程中需要考虑分选的速度和回收率。对于一些常见的免疫细胞亚群，也可以考虑使用磁珠分选产品进行分选，相比于流式分选，操作更简单、方便。如果有需要我们可以另外再针对细胞分选做具体讲解。

12. 检测细胞周期的时候细胞需要是活细胞，具体要怎么做？可以选用能穿透活细胞膜的DNA染料（例如Hoechst 33342）来进行活细胞的周期分析。

13. 测细胞因子需要先固定吧？检测胞内的细胞因子需要对先对细胞进行固定。

14. 用过流式分选的细胞如何再培养呢？如果流式分选的细胞要用于继续培养，要保证样本无菌，同时注意染色方案和分选过程对细胞活性的影响。在收集容器中预先加入一些完全培养基，将分选到的细胞用合适的容器和培养基继续培养。

15. 一般检测T细胞的哪些细胞因子需要加FC受体封闭液？FC受体表达于多种细胞类型上，包括单核细胞、巨噬细胞、B细胞、树突状细胞、粒细胞、NK细胞等。某些T细胞亚群（如γδT细胞、活化T细胞）也会表达FC受体。FC受体封闭液是用于封闭这些细胞上的FC受体消除非特异性结合。如果检测样品是经过分选的T细胞或细胞系（不表达FC受体），是可以不加FC受体封闭液。如果检测的样品是组织或外周血，是需要加FC受体封闭液。

16. 有单b细胞分离分选的方法介绍么磁珠法：阴选b细胞（过阴性分离从 PBMC 中分离纯的、活的非接触 B 细胞。该试剂盒可去除 T 细胞、NK 细胞、单核细胞、血小板、树突状细胞、粒细胞和红细胞）

17. 染色的时候如果用固定角转头，会有什么现象？这里应该理解为，染色后的样本需要进行洗涤，一般的流式管比较适用于水平式转头：这种转头是由吊着的吊篮（离心套管）构成，方便做密度梯度区带离心，其优点是梯度物质可放在保持垂直的离心管中，离心时被分离的样品带垂直于离心管纵轴，而不像角式转头中样品沉淀物的界面与离心管成一定角度，因而有利于离心结束后由管内分层取出已分离的各样品带。

18.胰腺组织制备单细胞悬液有哪些要注意的目前实体组织单细胞悬液制备的方法主要分机械法和酶消化法，由于胰腺组织中含有纤维组织，可采用剪碎溶酶和胰蛋白酶消化法。剪碎法操作简单而且细胞存活率高。

来源：流式细胞检测技术服务：https://cn.sinobiological.com/services/flow-cytometry-service