WB检测蛋白表达量原理：三种蛋白检测方法比较

xiaoqin

Western Blot（WB）,即蛋白质印迹法（免疫印迹试验）。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。蛋白质印迹法是由瑞士米歇尔弗雷德里希生物研究所（Friedrich Miescher Institute）的Harry Towbin在1979年提出的。在尼尔·伯奈特（Neal Burnette）于1981年所著的《分析生物化学》（Analytical Biochemistry）中首次被称为Western Blot。

蛋白免疫印迹（Western Blot）是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。

wb检测原理与Southern Blot或Northern Blot杂交方法类似，但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

【WB检测操作步骤】

一、蛋白样品准备收集蛋白样本，加入蛋白上样缓冲液混匀，100℃加热5 min，充分变性蛋白。

二、电泳与转膜1，SDS-PAGE凝胶制备；2，取适量样本上样，先在浓缩胶中用100-120 V电泳跑胶至分离胶，后增加电压到120-150 V电泳至目的蛋白已经最大化的分离；3，电泳结束，将分离胶转移至预冷的转膜液中，200-250 mA恒流转膜2 h。

三、蛋白杂交及显色

1、洗膜：转膜结束后，将蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，直至洗膜液洗尽；

2、封闭：将膜小心放入封闭液中，摇床上轻微摇晃，室温下封闭 1-1.5 个小时，或4℃ 封闭过夜；

3、一抗孵育：吸尽封闭液，加入稀释好的一抗,室温摇床上孵育1.5小时或者4°C孵育过夜；

4、二抗孵育：将膜转移至稀释好的二抗，室温下杂交1-2小时。

5、EC化学发光，显影，定影，将胶片进行扫描或拍照。实例展示（Xu S , Wang P , Zhang J , et al. [J]. Molecular Cancer, 2019, 18）本研究通过全转录组测序，筛选并锁定长链非编码RNA EGOT作为研究靶标。通过实验表明EGOT能增加乳腺癌细胞对紫杉醇的敏感性，并且在机制上雌激素通过ER-NRIP1-AP1三元复合体，转录抑制EGOT的表达，从而增加肿瘤细胞自噬水平并提高对紫杉醇的敏感性。

蛋白表达不同检测方式的比较和分析

1、免疫组化法(immunohistochemistry)

原理:免疫组化，是应用免疫学基本原理一-抗原抗体反应， 即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。

特点:是融合了免疫学原理(抗原抗体特异性结合)和组织学技术(组织的取材、固定、包埋、切片、脱蜡、水化等)，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色，来对组织(细胞)内抗原进行定位、定性及定量的研究(主要是定位)。样本是

细胞或组织，要在显微镜下观察结果，可能出现膜阳性、质阳性和核阳性。

2、蛋白免疫印迹( Western Blolt）

原理:蛋白质印迹法是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术。

特点:先要进行SDS-PAGE，然后将分离开的蛋白质样品用电转仪转移到固相载体.上，而后利用抗原-抗体-标记物显色来检测样品，可以用于定性和半定量。

3、ELISA检测

原理:酶联免疫吸附剂测定法，简称酶联免疫法，或者ELISA法，它的中心就是让抗体与酶复合物结合，然后通过显色来检测。

特点:用到了免疫学原理和化学反应显色，待测的样品多是血清、血浆、尿液、细胞或组织培养上清液，因而没有用到组织包埋、切片等技术，这是与免疫组化的主要区别，操作上开始需要将抗原或抗体结合到固相载体表面,从而使后来形成的抗原抗体-酶底物复合物粘附在载体上，这就是“吸附”的含义。

免疫组化和elisa所用到的原理大致相同，只是因为所检测的样品不同，从而在操作方法上有所不同。Elisa多用于定量分析，其灵敏度非常高。

三种蛋白检测水平的比较

各组检测方法之间的差别及特点:

以下是western和ELISA的区别:

western botting可以看到特异性的条带，但是定量比较烦

ELISA可以直接读出浓度，但是如果抗体有非特异性结合，那得到的数值就不可信。

WB只能半定里，但是可以检测细胞膜蛋白，这点ELISA做不到

4.ELISA可用定量方法检测蛋白,也就是说可以观察不同浓度刺激物对目的蛋白的影响

WB所检测的一般是抗原，而ELISA抗原抗体都可以检测。

WB所检测的抗原可以知道其分子量的大小，或是否是多聚体、降解产物等，WB可以确定所用抗体是与那种蛋白起作用的;而ELISA无能为力。

WB所适用的一抗一般是线性位点的，ELISA线性或构象型抗体都可以使用。从另一个意

义上讲，WB可以做抗体是线性位点还是构象型位点的补充判定，而ELISA不行。

WB 一次处理里就是一块胶版，10-20个样品最多了。ELISA一块96孔板一次可以处理96个样本，可以设置多个复孔、对照、梯度样等来提高检测的可信度。

WB操作常见的非特异性条带，膜本底差，显色不好等缺点在ELISA上表现得要好得多。

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