“蜡”开新局：巧妙利用相变温控，让CRISPR-POCT告别开盖污染

WIAT平台由一个200 μL反应管和其中的蜡隔板组成。蜡隔板把管内空间分为两个反应腔，一个是RPA扩增腔，另一个是CRISPR检测腔。RPA反应液和CRISPR-Cas12a反应液分别加入两个腔室。

首先，反应管在39°C孵育20分钟，以进行RPA扩增。由于蜡隔板熔点为44–46°C，RPA扩增液和CRISPR检测液彼此隔离。RPA扩增结束后，温度升至46°C。蜡隔板熔化，RPA产物自动与CRISPR反应液混合。若样本中存在目标DNA，RPA扩增产物会激活Cas12a，产生荧光信号。阴性样本则无明显荧光（如下图）。

作者设计了蜡隔板阴模，再用3D打印技术和Grey Pro树脂制备模具。制备蜡隔板时，作者将55–60 μL熔融石蜡加入PCR管中，把预处理过脱模剂的3D打印模具插入液态蜡中。冷却固化后取出模具，就在PCR管内形成固定形状的蜡隔板。模具脱模后可以清洗并重复使用（图A）。用红绿染料显示加热前两个腔室能够稳定分隔，加热后液体合并（图B）。与此前一些蜡基RPA-CRISPR系统相比，WIAT的预成型蜡隔板能形成明确的RPA和CRISPR腔室，不需要每次新鲜制备蜡屏障，更利于规模化和批量生产。

作者系统比较了三种脱模剂，矿物油、硅胶脱模**和凡士林。结果显示，矿物油和硅胶脱模剂会导至蜡隔板不完整或受损，而凡士林可以稳定获得结构完整、几何形状清晰的蜡隔板。

作者测试了不同蜡隔板壁厚，包括0.8、1.1和1.4 mm。如果蜡壁太薄，脱模过程中容易损坏，太厚会占用过多反应体积，影响腔室容量。综合结构完整性和反应空间，作者最终选择1.1 mm 作为后续实验的蜡壁厚度。作者使用熔点为44–46°C 的石蜡，并用染料测试39–46°C之间的相变行为。结果显示，46°C时所有管都出现完全、均匀混合，约1.5分钟内形成一致分布。因此，作者选择46°C 作为CRISPR反应启动温度。作者还测试了5、10和15 μL 三种RPA体积，同时保持CRISPR反应液为20 μL。结果显示，10 μL RPA体积能够产生阳性与阴性的显著分离（下图B）。

作者使用10倍梯度稀释的HSV-2 DNA评估检测灵敏度，浓度范围从10 aM到10 fM。结果显示，WIAT平台可以清楚地区分最低测试浓度10 aM 和阴性对照，并且差异具有统计学显著性。随着靶标浓度升高，CRISPR荧光信号也相应增强。作者还使用相同梯度样本做传统两步RPA-CRISPR，与WIAT平台进行直接比较。结果显示，两步法与WIAT灵敏度相当，同样可达到10 aM水平（如下图）。不过，两步法荧光强度更高、背景更低，这可能是因为WIAT中熔化后的蜡层对荧光有一定衰减。

除了灵敏度，作者还使用包括HSV-2、HSV-1、HPV16、HPV18、HPV31和HPV33在内的多种核酸靶标评估了WIAT平台的检测特异性，结果表明WIAT平台具有优异的特异性。总体而言，这些结果表明，单步WIAT平台可在低于10 aM的浓度下特异性地检测到HSV-2 DNA，其灵敏度与传统的两步RPA-CRISPR流程相当。

作者进一步用临床HSV-2拭子样本验证WIAT。作者先从样本中提取DNA，再分别进行qPCR和WIAT检测。共测试了30份临床拭子样本，其中1–13号为qPCR阳性，14–30号为qPCR阴性。

WIAT检测结果显示，它正确识别了13个qPCR阳性样本中的12个。唯一漏检的是Sample 10，该样本qPCR阳性但Ct值为34.4，提示病毒载量接近当前平台检测下限。在17个qPCR阴性样本中，WIAT没有产生阳性信号，显示出良好特异性。总体来看，WIAT与qPCR结果高度一致（如下图）。

作者提出的WIAT平台是一种利用蜡相变实现自动分步反应的一管式RPA-CRISPR检测平台。系统在一支200 μL反应管内用预成型蜡隔板分隔RPA扩增液和CRISPR-Cas12a检测液。RPA扩增后升温至46°C后蜡熔化，两侧液体自动混合，RPA产物激活Cas12a并产生荧光信号。WIAT用于HSV-2 DNA检测时可达到10 aM 灵敏度。灵敏度和特异性测试均良好。在30份临床HSV-2拭子样本中，WIAT检出12/13个qPCR阳性样本，阴性样本均未出现阳性信号。

不过，WIAT目前仍不是完整POCT产品。它仍需要前端核酸提取，临床样本量较小，低病毒载量样本存在漏检风险，蜡层可能影响荧光读数，多重检测和长期储存稳定性也还需要验证。未来如果能进一步整合免提取样本处理、冻干试剂、内参控制、侧向层析或便携荧光读数，并完成更大规模临床验证，WIAT有潜力成为一种非常实用的低成本封闭式RPA-CRISPR检测平台。总之，WIAT重新设计了RPA和CRISPR在管内相遇的方式，结构简单，成本低。WIAT最适合的场景，是需要低设备依赖、低污染风险、操作简单的近患者检测。