短串联重复序列扩增是多种神经系统和神经肌肉疾病的重要遗传基础。包括强直性肌营养不良1型和2型（DM1/DM2）、脆性X综合征、肌萎缩侧索硬化等疾病，都与特定重复序列异常扩增有关。对于这类疾病，重复次数不仅决定是否致病，也常常影响发病年龄、疾病严重程度和遗传不稳定性。因此，准确测量重复序列长度是相关疾病研究中的核心问题。重复序列检测的传统方法通常依赖PCR、片段分析、Southern blot、小池PCR或短读长/长读长测序。然而，串联重复区域高度均一，容易造成PCR滑移、扩增偏倚。短读长测序往往不能测完扩增区域，而长读长测序在同聚物、重复区域和GC-rich区域仍存在较高错误率及算法挑战。 近日，英国剑桥大学联合塞尔维亚的研究机构在杂志Nature Communications上发表了一篇题为“Quantification of disease-associated RNA tandem repeats by nanopore sensing”的文章。作者通过构建RNA:DNA纳米结构，把RNA分子上的重复序列编码为可被固态纳米孔读取的电流信号，从而在不进行逆转录、不进行PCR扩增、不依赖碱基逐个读取的情况下，直接对RNA串联重复长度进行单分子定量。研究显示，该方法可区分DM1相关CUG重复、DM2相关CCUG重复以及CCHS1相关GCN重复，并达到18 nt的分辨率。
图片来源：Nature Communications 这项研究不是直接读碱基，而是把RNA变成带条形码的纳米结构（下图a）。作者将目标RNA与一组互补DNA寡核苷酸杂交，组装成RNA:DNA纳米结构。这些DNA寡核苷酸可帮助形成可被纳米孔稳定读取的结构，同时在特定位置引入结构标签，比如单价链霉亲和素。当这个纳米结构通过固态纳米孔时，RNA:DNA骨架会造成一段基础电流阻塞，而较大的结构标签通过纳米孔时，会产生更深的电流尖峰。作者还设计了两个功能区，barcode区域和repeat-sensing区域。barcode可用于区分不同转录本或构型。repeat-sensing区域用于读取重复序列长度。重复越长，可结合的寡核苷酸和链霉亲和素标签越多，通过纳米孔时产生的电流尖峰就越深。 作者使用CUG重复作为概念证明。结果显示，含CUG重复的RNA:DNA纳米结构通过纳米孔时，先出现RNA:DNA骨架电流下降，再出现barcode对应的一组尖峰，最后出现repeat-sensing区域由多个链霉亲和素共同造成的深电流尖峰（下图d）。对于CCUG重复，作者也构建了类似结构，结果同样证明了此方法的可行性。
方法原理和设计 图片来源：Nature Communications 为了验证定量能力，作者使用DM1相关CUG重复作为模型。他们利用体外转录生成含不同重复数的RNA，包括12、24、30和51个CUG重复。12、24、30个重复属于非致病或野生型范围，而51个重复是DM1致病重复数。 作者给不同重复数的RNA:DNA结构设计了不同条形码，从而这些结构可以通过同一个固态纳米孔读取，避免不同纳米孔之间孔径和噪音差异带来的偏倚。结果显示，repeat-sensing区域的电流尖峰深度随着CUG重复数增加而升高。12、24、30和51 repeats的中位电流尖峰分别为0.09、0.37、0.42和0.61 nA，且之间均有显著性差异（下图d），长度分辨率约为18 nt。此结果说明这种结构编码式纳米孔检测具备潜在诊断相关性。随着重复序列进一步变长，电流尖峰深度可能会趋于饱和。作者还提出使用电流尖峰面积作为补充指标，即便电流深度趋于平台，尖峰持续时间和积分面积仍可能继续增加，有助于区分更长的重复阵列。
CUG串联重复序列的定量分析 图片来源：Nature Communications 作者进一步选择了CCHS1相关PHOX2B基因GCN重复作为模型。PHOX2B基因中的20个GCN重复，如扩增到26–33个会导至先天性中枢性低通气综合征1型。纳米孔读出结果显示，26个重复对应的repeat-sensing电流尖峰（0.8 nA）明显大于20个重复（0.15 nA），统计学差异显著。 除了DM1的CUG和CCHS1的GCN，作者还测试了DM2相关CCUG四核苷酸重复。DM2是由于CNBP基因内含子1中的CCTG扩增导至RNA中含有CCUG重复。结果显示，通过纳米孔时，barcode区域产生预期的电流尖峰，而repeat-sensing区域也产生可识别的重复信号。此结果说明，该方法并不限于三核苷酸重复，也可以扩展到四核苷酸重复，只要能够设计合适的互补寡核苷酸和结构标签，理论上甚至可以推广到其他STR或VNTR，只是不同重复序列的二级结构、GC含量、杂交稳定性和标签间距需要重新优化。 作者构建了一个DM1细胞模型，来验证系统是否能在复杂生物样本中工作。作者将含CTG重复的片段插入EGFP表达载体的3′UTR，并转染HEK293T细胞，并在尝试其总RNA中检测CUG。qPCR估算目标mRNA浓度约为2.1 nM，作者在total RNA背景中加入目标DNA寡核苷酸，特异性地把目标mRNA组装成RNA:DNA纳米结构。纳米孔结果显示，不含CUG重复的对照mRNA纳米结构只出现条形码和骨架信号，含CUG重复的mRNA纳米结构除了条形码外，还出现额外的repeat-associated电流尖峰（下图c）。这说明该方法能够在复杂total RNA背景中识别含重复序列的目标转录本。
纳米孔传感技术在复杂样本中的表征 图片来源：Nature Communications 这篇文章提出了一种重复序列检测策略，通过RNA:DNA纳米结构把RNA上的串联重复长度转换成可被固态纳米孔读取的结构标签信号，从而实现单分子、无扩增、无逆转录的RNA重复序列定量。作者在DM1相关CUG重复、DM2相关CCUG重复和CCHS1相关GCN重复中进行了验证，并展示18 nt的分辨率。此方法绕开了重复序列检测中最常见的两个偏倚来源，逆转录偏倚和扩增偏倚，也绕开了传统纳米孔或长读长测序在重复区域basecalling上的系统错误。它不依赖碱基级测序，而是用结构标签计数，因而更适合重复长度判定。 但这项研究距离临床还有距离。首先，目前主要验证的是体外转录RNA和转染细胞模型，而不是患者样本中的内源性重复转录本。此方法需要预先知道目标转录本序列，并依赖一组精心设计的DNA寡核苷酸。除此之外，通量、自动化、样本前处理和低丰度转录本捕获效率，仍需要进一步工程化优化。总之，对于重复次数检测，可以通过纳米结构工程把它转化为更容易读取的物理信号。这为重复RNA生物学、毒性RNA研究以及未来多重重复扩增疾病检测提供了一个新的技术方向。 注：本文内容仅供行业动态参考，不构成任何投资建议或临床医疗决策依据。 |
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