mNGS的阳判，没有标准答案

测得出，不等于判得准

我见过这样的场面：一份mNGS报告摆上桌，病原体的reads明明白白列在里面，可临床到底要不要按这个报阳性去用药，医生还是会犹豫。原因不复杂——同一个样本，换一套判读阈值，那份名单可能就变了。

所有人都觉得mNGS拼的是“测”：reads越多越准。但真正决定报不报阳性的，不是你测出了多少，是那道判读阈值定在哪儿。

测序仪今天已经高度标准化。建库、上机、出reads，流程成熟，门槛在往下走。可reads出来之后，报不报“阳性”，靠的是cut-off（阳性判断值，简单说就是“读数到多少算真的阳性”）。

这里有个容易被忽略的点。mNGS测出来的reads，不是只有病原体才有——人体本底、环境背景、试剂里的残留，都会贡献reads。所谓“测出来”，其实是在一堆噪声里辨认信号。

同一个样本，你把阈值定得松，背景菌也报出来；定得紧，真病原可能漏掉。reads多，只代表信号强，不代表信号真。

这也是为什么cut-off难定。传统PCR的阳性线是绝对的——Ct值到多少算阳，有试剂盒定值撑着。

mNGS没有这种绝对值，它的reads是相对的：今天试剂干净一点，背景低一点；明天样本溶血重一点，背景就飘。同一套阈值，换个批次可能就跑偏。所以cut-off不是一个数，是一整套和样本、和批次、和背景绑定的判读逻辑。

同一批下机数据，你把规则定成“临床样本和阴性质控的reads比率达到某个倍数算检出”，和定成“基于背景库算出来的标准化分数大于0才算检出”，报出来的病原体，可能完全不一样。

测是技术活，判是判断活。技术活有标准，判断活没有。

这就是mNGS最反直觉的地方：报得准不准，不靠你测出了多少，靠你那道阈值定在哪儿。测序解决的是“看没看见”，cut-off解决的是“看见了算不算数”。

你以为有公式，其实共识没规定

第二个反直觉的地方，更狠。

很多做注册的人，下意识觉得阳性判断值就是“套个公式”：RPM算一算、标准化分数算一算，不就出来了？

可事实是——国内相关专家共识，对计算公式没有明确要求。

这是一份审评综述里的原话。注意，它不是说“公式难算”，是说“连该用哪个公式，都没人替你定”。

这和我们做传统IVD的体感完全不同。做个PCR、做个化学发光，cut-off怎么定、参考区间怎么建，路径清楚，指南一篇接一篇。

到了mNGS这儿，情况变了：测序产生的数据维度太多、背景微生物太杂、临床场景太碎，同一种病原体在血流里和脑脊液里背景完全不同，在成人身上和新生儿身上也不同。

举个例子，血流感染里常见的定植菌，在健康人血里也有极低水平的背景；可到了免疫低下患者身上，同样水平的reads可能就是真感染。共识没法用一个数字同时罩住这两种人——它只能要求你，把你的目标人群、你的样本处理、你的背景库，都讲清楚。

所以共识能达成的上限，只是“你得有依据、你得验证”，至于用哪套算法，自己选、自己负责。它定不了，是因为客观上就不存在一个放之四海皆准的公式——这道关，没有现成参考答案可抄。

没有公式，那就三套各写各的

既然共识不规定，行业里自然并行跑着几套做法。

最常见的第一种，叫RPM比率法。它的判读规则是：把检测reads标准化成RPM（每百万条reads里的读数占比），算临床样本和同批次阴性质控的reads比率，比率够高才报检出；RNA病毒则要覆盖参考基因组不少于若干个不重叠区域才报。

这套是迄今最大规模脑脊液mNGS前瞻性研究里用的，一年里美国多家医院两百多例患者的数据。

第二种，覆盖度加临床相关性法。先剔掉阴性对照里的污染菌reads，剩下的微生物，要满足reads标准化值超过一定阈值、且覆盖参考基因组的不同位置、再叠加“在这个患者身上有潜在致病性”，才判潜在病原。

第三种，标准化分数法（Z-score）。它先拿一系列阴性样本和空白质控，建一个背景微生物库，再算每样本每种微生物的标准化分数；分数为负的，说明比本底还小，判非致病；正值里最靠前的，结合临床症状相关性判读。

三套都在用，没有谁被官方钦定为“唯一正确”。三套并存，不是因为哪一整套不严谨，而是因为它们各自适配的场景不同：RPM比率法对高载量病原体友好，覆盖度法更看重“真的覆盖到”，Z-score法擅长压住背景噪声。

场景不同，最优解不同，所以谁也吞不掉谁。

更麻烦的是细节也各说各话：阴性对照到底怎么算、用什么方法做对比验证、覆盖度到多少算够——不同团队、不同产品，答案都不一样。

你抄我的，我抄他的，审评老师问一句“你凭什么定这个数”，全场安静。

所以你看，三套算法没有谁错，错的是以为有一套能直接抄。mNGS的背景微生物，每个人群、每类样本都不一样，抄别人的阈值，等于穿别人的鞋走路——看着能穿，走两步就磨脚。

落到注册上：审评要的是“你凭什么定”

讲到这，企业最该关心的结论来了。

mNGS的cut-off没有标准公式，不等于你可以随便定。恰恰相反，审评要的是你能把“你凭什么定这个数”讲明白。

阳性判断值研究有几个硬要求是清楚的：要用充分覆盖亚种、基因型、血清型的临床样本，不建议用模拟样本凑数；对比方法得是分子生物学结果，荧光PCR、数字PCR、测序都行；结果解读重点关注三样——reads数、基因组覆盖度、阴性对照reads数。

翻译成人话：你可以不套公式，但你得证明你的阈值是拿真实临床样本建出来的、是被验证过的、是和可靠方法比过的。

这件事，不是mNGS独有。

阳性判断值本来就是IVD注册的老痛点，放之四海皆准。肿瘤NGS的cut-off也是各家自建、各自验证，没有谁能拿一本通用手册照抄。mNGS只是把这件事的难度放大了——因为背景比肿瘤复杂得多。

换个角度看，这正是mNGS注册最难被“抄近道”的地方。传统IVD你还能扒友商的说明书、对齐行业标准；mNGS这道关，友商自己也在摸，行业标准还是空白，能参考的只有审评老师的几条原则。谁先把依据做厚，谁在审评桌上就少挨一刀。

把mNGS注册拆开看，cut-off是其中一道重点关，不是边角。

有意思的是，行业在补标准——GB/T 46943-2025《病原宏基因组高通量测序性能确认通用要求》今年发布，补的是mNGS实验室性能评价的国标空白。可你翻一遍会发现，性能确认的要求在收紧，唯独cut-off该用哪套算法，还是空白。

一边在补，一边还空着。

我接触过的mNGS团队，踩坑最集中的就两个地方。

一是迷信某一种算法——听说RPM比率法在脑脊液里好用，就原封不动搬到自己的血流感染产品上，忘了样本类型和背景菌完全不是一回事。

二是阈值定完，验证做得太薄，拿几个模拟样本凑数，真到被问“你凭什么定这个数”，答不上来。

这两个坑，本质是同一件事：把“判”当成了“测”的附属品，而不是一道独立的、要负责任的关。

避开这两个坑，办法不复杂，就是反着来：算法别迷信，拿自己的样本重跑一遍，看哪套在你的背景里最稳；验证别薄，临床样本铺够、对比方法选硬，把“我为什么定这个数”写成一段能站住的逻辑链，而不是一句“参考了文献”。

审评老师要的不是完美，是讲得通。这也是mNGS这道关，最后只认依据、不认套路的道理。

最后的话

测得出病原体，是技术的功劳。判得准不准，是那道阈值的功劳。

金匙那张证，证明mNGS在中国能走通注册这条路，这是真的突破。可证批了，阳性判断值这道题，没有因为证批了就自动有答案。

这道题从来就没有标准答案，只有谁把依据做得更扎实。

参考文献

1. 包雯.病原体宏基因组测序试剂生物信息学分析及阳性判断值确定的评价方法介绍[J].分子诊断与治疗杂志, 2024, 16(8).

2. Chiu K, et al. Diagnosis of Pathogenic Organisms by Metagenomic Next-Generation Sequencing of Cerebrospinal Fluid. N Engl J Med, 2019.

3. Doan T, et al. Metagenomic Next-Generation Sequencing of Ocular Fluids for Infectious Uveitis. 2016.

4. Wilson MR, et al. Metagenomic Next-Generation Sequencing for Pathogen Identification in Central Nervous System Infections. 2018.

5. 徐超.体外诊断试剂阳性判断值或参考区间研究解析.

6. 刘容枝.病原体宏基因组高通量测序产品技术审评重点关注点探讨[J].中国药事, 2026.

7. GB/T 46943-2025病原宏基因组高通量测序性能确认通用要求.