ANINA技术突破：室温下快速核酸检测的新革命

图片来源：Nature Communications

ANINA方法将扩增与检测整合于单一冻干反应体系中，可在20–45°C的广泛温度范围内运行，且整个检测过程仅需5–30分钟。ANINA包含了三种寡核苷酸（图b），Annexing Probe（AP）带有3′聚合酶阻断，不能被延伸，长度足够支持重组酶加载，且通常带有5′检测标签。Probe-adjacent primer（PP）位于AP旁边，功能类似正向引物。Downstream primer（DP）位于下游，功能类似反向引物，可带有biotin、digoxigenin等检测标签。

AP先形成重组酶-单链结合蛋白复合物，侵入双链DNA并结合互补序列，形成局部开放结构。随后，靠近AP的PP即使很短，也能在这个局部开放区域附近更容易退火并被Bsu链置换聚合酶延伸。PP延伸会把不能延伸的AP挤走，并暴露互补链供DP退火，从而推动扩增循环。因此，AP通过空间邻近效应，把PP招募到一个本来不容易发生扩增的位置。ANINA在25°C下，使用短PP以及DP仍能实现高效且特异的扩增，其长度远低于传统重组酶系统通常支持的范围。

ANINA机制示意图

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RPA的痛点是引物设计不够灵活。RPA通常需要长度为30-36 nt的引物，长引物较难找到合适区域，比如在高变异病毒、短保守区或需要多重检测的场景中。并且，引物越长越容易出现非特异结合和引物间相互作用。

ANINA实验中AP可以显著降低对长引物的依赖。作者在WSSV VP19靶标上测试了不同长度的PP和DP。所有的反应均在25℃下进行30分钟。结果显示，当没有AP时，只有较长引物组合能产生弱或不稳定扩增（图b）。加入AP后，包括15 nt PP+20 nt DP在内的短引物组合也能稳定扩增。

作者把PP位置相对于AP进行移动，发现如果PP的5′端离AP太远，比如超过17个核苷酸以外，短DP的扩增效率会明显下降。而如果PP更短但仍保持AP邻近，扩增反而可以成功。这个结果说明，扩增效率主要由AP和PP的5′端空间距离决定，不只由引物长度决定。

AP可以显著降低RPA对长引物的依赖

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AP在扩增后可以与产物形成检测兼容的稳定复合物，使扩增产物可以直接进入终点检测，并可兼容侧向层析和实时荧光定量，而不需要探针酶切或CRISPR辅助反应。

在WSSV VP19实验中，使用FAM标记AP和biotin标记DP时，只有模板存在的反应在LFA试纸上出现条带，具有比较强的特异性。ANINA还可以实现多重侧向层析读出。作者使用digoxigenin和biotin标记不同DP，在一个反应中观察到两个独立LFA测试线，且没有明显交叉干扰（图d）。作者还使用WSSV gDNA梯度稀释方法评估了分析灵敏度。结果显示，PAGE和LFA均能可靠检测1–10 copies/reaction，对应attomolar级别灵敏度（图f）。这个检测是在25°C下完成的，证明了ANINA低温扩增的可行性。

ANINA还可以做实时荧光定量。作者在反应中加入EvaGreen等DNA插入染料，在qPCR仪上以39°C恒温 运行，不进行热循环，记录实时荧光曲线，称为 qANINA.结果显示，qANINA在10⁰–10⁶ copies/reaction范围内产生浓度依赖性扩增曲线，不同输入浓度的信号可在约3–8分钟内达到阈值，估算qANINA的有效倍增时间约14.5秒。这部分结果说明，ANINA也可以进入定量分子诊断场景。虽然需要荧光读数设备，但无需热循环，因此仪器需求可以大幅降低。

AP可实现对ANINA扩增子的直接端点检测

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为了验证平台通用性，作者不仅检测WSSV，还把ANINA扩展到多类人类病原靶标，包括EBV（双链DNA病毒），RSV（单链RNA病毒）和淋病奈瑟菌。EBV和RSV使用人唾液作为背景基质，淋病奈瑟菌使用模拟尿液作为背景基质。结果显示，所有靶标都只在病原阳性样本中出现扩增和侧向层析信号，人源基质对照和无模板对照均无明显信号。

在EBV唾液基质灵敏度实验中，作者还将ANINA试剂冻干，用处理后的EBV-spiked saliva直接启动反应，PAGE和LFA均可在1–10 copies/reaction检出，仍然对应attomolar灵敏度。这说明ANINA是一个可扩展框架，可以覆盖DNA病毒、RNA病毒和细菌，并且能在复杂人源样本背景中保持特异性。

WSSV是白斑综合征病毒，是水产养殖尤其虾养殖中的重大病原。在自然暴露感染模型中，作者在感染后24和48小时采集虾的腹足和肌肉组织。作者把冻干ANINA试剂与一个2分钟无仪器组织提取流程结合，虾组织提取液直接加入冻干ANINA反应珠，在25°C或环境温度下反应30分钟，再直接稀释进优化检测缓冲液并上LFA试纸，总时间在45分钟以内。结果显示，ANINA检出了所有qPCR阳性样本，包括低至20 copies/μL的低病毒载量样本，且在未感染对照中没有假阳性（图d）。

无仪器的ANINA检测

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作者研发的ANINA是一种基于AP引导短引物招募的新型重组酶等温扩增框架。它通过AP打开目标双链DNA，并招募短PP完成退火和延伸，从而突破传统RPA对长引物和较高反应温度的依赖。实验显示，ANINA可在25°C下使用短至10 nt的PP和15 nt的DP完成特异扩增，并可在1–10 copies/reaction 水平实现LFA检测。 ANINA不仅可检测WSSV，也可扩展到EBV、RSV和淋病奈瑟菌等不同核酸类型病原。qANINA还能在39°C恒温下实现实时定量。在WSSV自然感染虾模型中，无设备工作流程可在45分钟内完成检测，并检出抗原快检漏掉的低病毒载量感染。

但这项研究也有一定的局限性。ANINA的AP、PP、DP的空间关系非常关键，新靶标需单独设计和验证，需要更广泛的设计工具和机制研究。文章虽然展示了多重LFA读出，但更高阶多重扩增仍未充分验证。其次，本文对EBV、RSV、淋病奈瑟菌主要使用加标人源基质样本，还需要在大规模真实临床样本进行验证。等温扩增普遍存在污染风险，标准污染控制实践仍然重要。最后，AP机制也仍需进一步结构解析。总之，ANINA用AP把短引物招募到目标位点，同时把扩增和检测连接起来，为低资源、现场化、无设备核酸检测提供了一条非常新颖的技术路线。

注：本文内容仅供行业动态参考，不构成任何投资建议或临床医疗决策依据。