摘要 近20年，超灵敏免疫检测技术加速从“信号放大”走向“单分子计数”与“数字化检测”。以Simoa、dSimoa、ddELISA、MOSAIC、SiMoT为代表的单分子/数字免疫平台，已将血液蛋白标志物检测推进至attomolar甚至单分子水平；电化学发光与电化学免疫传感借助RCA、纳米材料等策略持续提升灵敏度与临床适用性；PLA、RCA、SERS及外泌体分析则拓展了PD-L1阳性外泌体、糖基化蛋白等新型标志物维度。整体来看，技术已从单纯追求最低检测限，转向多重、自动化、低样本量、低成本的临床可及性竞争。未来真正能落地的，不一定是“最灵敏”，而是能稳定、自动地把超低丰度标志物变成可报告结果的技术。 背景 为什么“更灵敏”成了IVD的硬需求？ 在体外诊断领域，一个长期存在的矛盾是：临床知道该测什么，但技术未必测得到。 很多关键标志物在血液中的浓度极低。比如： · 神经退行性疾病的 Tau、NfL，在症状出现前可能只有 fg/mL 级别； · 肿瘤早筛和 MRD 监测所需的循环蛋白或外泌体标志物，常常淹没在高丰度蛋白背景中； · 免疫治疗相关的 PD-L1 阳性外泌体，数量稀少但临床意义重大。 传统ELISA和常规化学发光的灵敏度，大多停留在pg/mL量级。面对这些需求，技术必须向fg/mL、ag/mL，甚至单分子水平 推进。 于是，超灵敏免疫检测不再只是一个“性能优化”问题，而是决定早筛、早诊、疗效监测能否真正落地的关键。 过去近20年，超灵敏免疫检测大致走出了三条主线： 1. 单分子与数字免疫检测：从Simoa到各类数字化ELISA； 2. 电化学与电化学发光：经典平台通过纳米材料和信号放大重新升级； 3. PLA、RCA、SERS与外泌体分析：面向液体活检的新一代高灵敏策略。 下面分别展开。 01 单分子与数字免疫检测： 把“测浓度”变成“数分子” 如果要用一句话概括这一类技术的核心变化，那就是： 传统免疫检测是“测一个总体信号”，而数字免疫检测是“把样本分成无数微小单元，数出哪些单元里有一个待测分子”。 这种做法最大的好处是：即使待测分子极少，也能从背景中被识别出来。
1. Simoa： 单分子免疫检测的行业基准 Simoa是目前最成熟的单分子免疫检测平台。它的原理并不复杂：将免疫复合物固定在磁珠上，使每个磁珠最多对应一个待测分子，然后将磁珠分散到数十万个微孔中，通过荧光信号进行单分子计数。 Wang 2020[1] 的一项工作显示，Simoa不仅能检测蛋白，还能同时检测小分子和 microRNA。例如： · cortisol：LOD 0.031ng/mL · IL-6：LOD 0.018pg/mL · miR-141：LOD 0.019pM 更重要的是，多重化并未明显损害灵敏度和特异性。 这说明，Simoa已经从“单蛋白超高灵敏检测平台”，向“多靶标、多分子类型平台”演进。
2.dSimoa： 把灵敏度再往前推一步 Simoa虽然灵敏，但在极低丰度分子的采样效率上仍有提升空间。 Wu 2020[2] 提出的 dSimoa（dropcast single molecule assay），通过改进磁珠在微孔中的分布方式，提高了低丰度分子的采样效率。结果显示： · IL-10和IL-1β达到低至中attomolar级LOD； · 相比常规Simoa，灵敏度分别提升25倍和15倍； · 更重要的是，dSimoa在血浆中检测到了此前难以测到的脊索瘤标志物Brachyury。 这说明，单分子检测的灵敏度还可以继续被“优化”，而不只是依赖设备升级。
3. ddELISA： 液滴微流控 + 数字ELISA Cohen 2020[3] 提出的ddELISA，将数字ELISA与液滴微流控结合。其最低计算LOD达到20 aM，较Simoa最高提高约25倍灵敏度。 更重要的是，ddELISA首次在血清中测到了潜在癌症标志物LINE1/ORF1蛋白。这个结果的意义在于：许多此前被认为“不可测”的潜在标志物，可能只是因为技术不够灵敏。
4. 从“更灵敏” 到“更可及” 技术一旦进入临床，就不再只是拼灵敏度，还要拼可操作性。 MOSAIC[4] 和 efMOSAIC[5] 是两个代表性方向： · MOSAIC可以在血浆、唾液中，以极少量样本完成高多重超灵敏检测； · efMOSAIC则采用无酶杂交链式反应放大，检测限与Simoa相当，但对磁珠和酶依赖更低。 Wu 2025[4] 还报道了一种无磁珠PDMS微孔阵列数字ELISA，人IL-6检测限达到12.3fg/mL。其意义不在“最高灵敏度”，而在以更低成本保持超高灵敏度，更适合大规模筛查和资源受限环境。
Scandurra 2023[6] 的SiMoT则走得更远：IL-6检测限达到20zM，相当于在0.1mL 样本中检测1±1个蛋白分子。而且它采用无标记、30分钟检测，适合超灵敏POC方向。
从以上资料分析得到单分子与数字免疫检测的演进逻辑已经很清楚： 第一阶段，证明可以测到 attomolar； 第二阶段，证明可以多重、高通量地测； 第三阶段，让方法更简单、更便宜、更接近临床。 02 电化学与电化学发光： 经典平台的“重新武装” 电化学发光免疫分析已经是IVD领域非常成熟的平台。但这不意味着它没有进步空间。 近年的主要策略，是通过磁性分离、滚环扩增、纳米材料等手段，进一步提高信号强度和信噪比。 磁性RCA辅助自动化ECLIA Zhang 2025[7] 报道的磁性RCA辅助自动化ECLIA，是一个很典型的例子。该方法用于cTnI和AFP检测： · cTnI LOD：0.1pg/mL · AFP LOD：0.3pg/mL · cTnI检测结果与临床结果线性相关良好，R²=0.9471
碳点功能化电化学夹心免疫 Anbalagan 2024[8] 则用碳点功能化电化学夹心免疫传感检测CEA。LOD为10pg/mL，线性范围0.5–50ng/mL，较常规电化学夹心免疫分析灵敏度提高3.5倍，且与CMIA结果一致。 球形核酸模板Ag纳米簇夹心电化学免疫传感 Chen 2022[9] 报道的球形核酸模板Ag纳米簇夹心电化学免疫传感，将AFP检测限压到7.74fg/mL，线性范围跨越0.001–100ng/mL。 这些工作的共同点在于：不是推翻电化学平台，而是用新材料和新放大策略提高上限。 Chen 2023[10] 的综述进一步指出，电化学免疫传感已经覆盖癌症、阿尔茨海默病、新冠等多疾病标志物，未来方向集中在更低LOD和复合功能材料。 从产业角度看，电化学发光在自动化、通量和成本上仍然具有巨大优势。因此，它的“超灵敏化”对临床IVD更具现实迁移价值。 03 PLA、RCA、SERS与外泌体： 液体活检的新入口 如果说前两类技术更多是在“把一个蛋白测得更准”，那么PLA、RCA、SERS和外泌体方向，则更像是在开拓新的标志物维度。 1. 外泌体 PD-L1：不只是“测蛋白浓度” PD-L1在肿瘤免疫治疗中极其重要，但组织活检有创、异质性强，血液中的可溶性PD-L1又不一定反映真实免疫抑制状态。 Ye 2025[11] 开发的双适配体PLA引导RCA方法，专门检测EpCAM和PD-L1双阳性外泌体。其LOD为7.5particles/μL，无需额外纯化即可100%区分癌症患者与健康供者。 这说明，未来的超灵敏免疫检测，可能不再只是报告“PD-L1有多少pg/mL”，而是报告“有多少个PD-L1阳性肿瘤来源外泌体”。
2. 糖基化标志物：进入翻译后修饰层面 Fu 2021[12] 和Xu 2023[13] 的工作，都把PLA-RCA用于糖基化PD-L1的检测。 · Xu 2023对糖基化PD-L1的LOD为1.04×10⁴particles/mL； · 对糖基化PTK7的LOD为2.759×10³particles/mL。 这类检测的意义在于：很多疾病相关变化不只体现在蛋白表达量，还体现在翻译后修饰上。 糖基化PD-L1可能比总PD-L1更反映免疫逃逸状态。
3. SERS+机器学习：多标志物组合筛查 Resmi 2024[14] 的工作将SERS免疫分析与机器学习结合，用于血浆中Aβ40、Aβ42、p-tau、t-tau的检测LOD达到attomolar级，动态范围跨越aM–μM。 这种平台的核心优势不是“单指标更灵敏”，而是可以在血液中对多个低丰度中枢神经系统标志物同时检测，并通过算法提高判别能力。 这对于阿尔茨海默病和轻度认知障碍的早期筛查，具有重要价值。
4. Plasmonic ELISA：让传统ELISA再进一步 Shoukat 2025[15] 的综述系统梳理了plasmonic ELISA，包括微流控、SERS-ELISA、CRISPR-enabled ELISA等。 总体来看，这类方法可以把传统ELISA的检测限提升10倍到1000倍以上。已有应用覆盖： · 早癌标志物； · 感染病标志物，如SARS-CoV-2 N蛋白； · 心血管标志物，如Myo。 不过，作者也明确指出，plasmonic ELISA仍面临标准化、复用整合和规模制造方面的挑战。 这也提醒我们：从实验室到IVD产品，距离往往不在“最灵敏”，而在“最稳定、最好做、最好报证”。
04 技术趋势： 从“测得到”到“测得起、测得稳” 把近20年这些代表性工作放在一起看，可以归纳出几个非常清晰的趋势： 趋势一 检测限从pg/mL全面走向fg/mL、ag/mL 传统化学发光和ELISA 多在pg/mL量级；而当前数字免疫检测、SERS免疫分析等，已经普遍进入attomolar甚至单分子水平。 趋势二 从“单一标志物”走向“多重标志物组合” Simoa多重检测、MOSAIC、efMOSAIC、SERS机器学习等，都在强调多靶标同时检测。未来的早筛和疗效监测，很难依赖单一标志物。 趋势三 检测对象从“蛋白浓度”扩展到“外泌体、翻译后修饰” PD-L1阳性外泌体、糖基化PD-L1等，代表了一类新的检测维度。它们更接近功能状态，也更可能成为液体活检的关键指标。 趋势四 灵敏度不再是唯一竞争点 多个工作开始强调： · 样本量更少； · 不需要大量磁珠； · 不需要额外纯化； · 更适合自动化； · 更适合资源受限场景。 从以上资料看，数字免疫检测仍是最集中的主线，包括Simoa、ddELISA、dSimoa、MOSAIC、efMOSAIC和无磁珠数字ELISA，核心优势是把低丰度分子转化为单分子或数字计数信号，从而把灵敏度推进到fM甚至aM范围。 另一条主线是信号放大型免疫分析，包括RCA增强ECLIA、Ag纳米簇电化学传感、碳点电化学免疫传感、PLA/RCA外泌体检测和SERS免疫分析。它们共同依赖核酸扩增、纳米材料、等离子体或表面增强效应来压低检测限，并把应用扩展到肿瘤EV、AD血液标志物、感染和心血管标志物。 未来真正能进入临床的超灵敏免疫检测，不一定是“最灵敏”的那一个，而是能稳定、自动、低成本地把attomolar级标志物变成可报告结果的那一个。 05 新一代超敏免疫检测技术方法及产品 杭州乐为生医科技有限公司自主研发的USI-NA™平台代表了新一代蛋白超敏免疫检测技术方向。其核心原理是将免疫学的高特异性与核酸扩增的超高灵敏度相结合，可实现fg/mL级别的痕量生物标志物检测，线性范围5个log，产品性能稳定。
06 以上研究资料中涉及到的标志物信息梳理 1、单分子与数字免疫检测
2、电化学与电化学发光
3、PLA、RCA、SERS与外泌体方向
注：本文内容仅供行业动态参考，不构成任何投资建议或临床医疗决策依据。 |
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