很多危重症患者在临床上看起来属于同一种综合征，例如脓毒症、急性呼吸衰竭、急性呼吸窘迫综合征、创伤性脑损伤或急性肾损伤等，但其背后的免疫状态和分子病理可能完全不同，具有显著的生物学异质性。这些亚表型表现出不同的基础免疫特征和对治疗的差异性反应。尽管循环蛋白生物标志物可用于分层这些患者，但通常依赖中心实验室，样本从ICU采集后送到实验室，往往需要等待数小时到1–2天，检测结果很难真正嵌入急性治疗决策。对于重症患者而言，最佳干预窗口通常仅以分钟到小时为单位。 近日，纽约大学坦顿工程学院及其他研究机构在杂志Microsystems & Nanoengineering上发表了一篇题为 “An automated, digital immunoassay on a microfluidic cartridge for on-demand cytokine profiling”的文章。作者提出了一套名为ADAPT的自动化数字免疫检测平台，用于精准治疗的自动化数字检测。它把磁珠捕获、免疫反应、洗涤、酶标记、底物孵育、油封分隔和数字荧光读数整合在一个一次性微流控卡匣中，用于近患者、按需检测细胞因子和炎症蛋白。ADAPT可在约45分钟内完成蛋白检测，达到亚pg/mL级灵敏度，检测 sTNFr1、IL-8和IL-6 三个ARDS/PARDS炎症亚型相关标志物，LOD分别为0.188、0.810和0.128 pg/mL，并且在儿童急性呼吸衰竭/ARDS血浆样本中与Luminex结果高度相关，R²达到 0.925–0.979。
图片来源：Microsystems & Nanoengineering 主要内容 数字免疫检测ADAPT平台的概述 ADAPT属于数字免疫检测。捕获目标蛋白的磁珠分散至含有大量微孔的检测芯片，每个微孔仅容纳单颗或少数磁珠，使每个微孔形成独立反应单元。通过统计阳性微孔比例，实现单分子级蛋白定量。数字免疫检测的优势在于，把单个分子事件转化为大量微孔中的开/关事件，这样可以显著提高低丰度细胞因子的检测灵敏度。最大的难点是操作复杂，需要精确磁珠处理、严格洗涤、底物孵育、油封分隔和高质量成像。ADAPT将这些步骤都整合进自动化微流控卡匣。用户只需加入血浆和试剂，最大限度地减少了人工流程，并且样品到结果的周转时间仅需45分钟。 ADAPT平台由三个主要模块组成（图a）。一个中央控制单元，内含单板计算机和执行器。一个一次性组件，包括流体卡匣和集成的检测芯片。还包含一个可重复使用的歧管（manifold），用于连接仪器与一次性组件，并隔离硬件与生物流体。
ADAPT平台概述。图片来源：Microsystems & Nanoengineering 流体网络的表征与性能优化 检测芯片设有八个并行通道，可同时对多个样品进行测量。系统通过6个夹管阀控制液体流动。线性执行器压下或抬起弹性膜，从而开关流路。ADAPT将传统数字ELISA中最容易引起操作者差异的步骤自动化。尤其是洗涤和油封，这两个步骤对信噪比和阳性微孔计数非常关键。洗涤不足会引起背景升高，油封不稳定，微孔间信号会串扰。ADAPT通过卡匣内流体控制，减少了人工移液和乳化操作的不稳定性。 作者还对流体网络进行了特性分析与性能优化。作者优化了上下层入口和出口之间的液阻关系，使激活入口的阻力路径占优，而非激活路径被隔离，从而减少交叉污染。作者还测试了样本和试剂的加样体积与压力。结果显示，样本储液池分配100 μL、试剂储液池分配200 μL后，8个通道的加载效率可接近100%。约300 μL洗涤液足以完成试剂去除和背景抑制（图d）。3个短促高压脉冲可在约15秒内达到约95%混合效率（图e）。
流体网络特性分析与性能优化。图片来源：Microsystems & Nanoengineering ADAPT平台对sTNFr1、IL-8和IL-6的分析性能 ADAPT选择了三个炎症亚型相关标志物sTNFr1、IL-8和IL-6。这三个标志物已经在成人ARDS和儿童急性呼吸衰竭/ARDS亚型研究中被用于区分炎症亚表型，具有较明确的临床转化背景。 作者用重组蛋白加标实验建立了ADAPT平台的sTNFr1、IL-8和IL-6标准曲线。结果显示，sTNFr1的LOD达到0.188 pg/mL，LOQ为24.97 pg/mL。IL-8的LOD为0.810 pg/mL，LOQ为22.36 pg/mL。 IL-6的LOD为0.128 pg/mL，LOQ为5.01 pg/mL。sTNFr1动态检测范围约为25–2441 pg/mL，IL-8约为22–285 pg/mL，IL-6约为9–1100 pg/mL。宽的动态检测范围对重症炎症检测非常重要。ICU患者的细胞因子水平变化范围非常大，ADAPT可让这些marker在生理范围内尽可能一次检测成功。 作者还评估了ADAPT平台的特异性。结果显示，sTNFr1、IL-8和IL-6检测中非目标抗原产生的信号基本接近背景水平，互相之间无交叉反应（图d）。重复性方面，ADAPT的通道内/卡匣内变异较低。8个平行通道之间的CV为6.25%，不同卡匣之间的CV在3%–21%之间，主要来自手工装配和层压制造差异。
ADAPT平台的分析验证。图片来源：Microsystems & Nanoengineering 临床实用性验证 作者使用儿童急性呼吸衰竭/ARDS患者血浆样本，将ADAPT检测结果与Luminex平台比较。尽管系统对sTNFr1、IL-8和IL-6的线性动态范围分别为2441、285和1100 pg /mL，但非线性回归可将可检测范围扩展至10000 pg /mL（sTNFr1）和3200 pg /mL（IL-8/IL-6）（图a）。结果显示三项指标均与Luminex高度相关，sTNFr1检测R² = 0.9790，IL-8的R² = 0.9245，IL-6的R² = 0.9612。 这些结果说明，ADAPT在真实复杂血浆基质中能够与成熟多重免疫平台保持较好一致性。
ADAPT平台的临床实用性。图片来源：Microsystems & Nanoengineering 总结与讨论 作者提出了ADAPT平台，是一套面向ICU精准医学的自动化微流控数字免疫检测系统。用户只需加入血浆和试剂，它把后续步骤整合到一次性卡匣中，可在约45分钟内完成sTNFr1、IL-8和IL-6三项炎症标志物检测，最大限度地减少了人工流程。在儿童急性呼吸衰竭/ARDS血浆样本中，ADAPT平台结果与Luminex结果高度相关。 但这项研究仍处于技术验证和小规模临床样本验证阶段。尚未完成新鲜全血样本的真实ICU床旁流程，还需要进行前瞻性亚型分层和临床结局改善验证。其次，批次间稳定性还需进一步优化，全血分离、光学小型化和panel扩展也需要后续工程开发。总之，ADAPT通过自动化数字免疫微流控卡匣，把高灵敏细胞因子检测向近患者的即时检测推进了一步。对于未来ARDS/PARDS亚型分层、多中心生物标志物验证和重症精准治疗试验，此平台值得持续关注。 注：本文内容仅供行业动态参考，不构成任何投资建议或临床医疗决策依据。 |
/3 
浙公网安备33010802005999号 
