一文读懂，测序到底怎么回事

做 NGS 这么多年，我发现一个怪现象：很多人天天跟测序仪打交道，却说不清「测序」这两个字里到底发生了什么。客户问一句「这个变异是怎么测出来的」，支支吾吾答不上来。

今天我们不讲话术，就用 6 张简单的图，把从「一份样本」到「一份报告」的全过程捋一遍。看完你至少能跟客户讲明白。

1 测序的本质：把 ATCG 读出来

图1 ｜ 人的基因组是23对染色体，基因组是 30 亿字的生命之书，每个字是 A / T / C / G 四种碱基之一，那对人的全基因组测序就是把 30 亿个碱基对按顺序读出来。

测序（Sequencing）的本质，就是确定 DNA 上 A/T/C/G 的排列顺序。顺序不同 → 遗传信息不同 → 决定了你是你、为什么会不一样。

▎ 📌 客户可能会问

测的是全基因组，还是只测其中一段？

▎ 💡这个都有可能

大部分临床场景不是全测，是「靶向捕获」——只测你感兴趣的那段，比如全基因组测序（WGS）就是测所有的基因组，全外显子（WES）测序就是只测基因组上全部的外显子（当然也包括部分上下游区域）。这点后面细讲，今天先把整体感建立起来。

2 太长读不动：先打断成小片段

图2 ｜ 染色体太长，先随机打断成几百碱基的小片段，当然这个是示意图，实际情况是23对染色体都会随机打断。当然这里具体的还分物理打断法和酶切打断法等，游离 ctDNA 片段天然偏短，很多流程直接省略打断步骤；扩增子 Panel 无需基因组打断。情况很多，我们后面会详细讲。

NGS测序又称下一代测序，也叫二代测序，有说法也称大规模平行测序，先把长基因组随机打断成几百万个小片段，再「并行」测序所有片段——这是「高通量」的关键。每个小片段独立测序 → 得到一条条「reads」——像把一整本百科全书撕成一页一页。

▎ 💡打断会影响数据质量

打断这一步看着简单，其实决定了后面数据的均匀度。片段尺寸分布失衡，是测序深度不均、数据偏倚的重要诱因之一。严重影响测序结果。

3 加「接头」：给每个片段装上「把手」

 图3 ｜ 两端接上通用接头，机器才抓得住、认得出，这也是为什么不同测序平台文库不能通用的原因。接头是已知序列，相当于给片段贴「锚点 / 条形码」。

接头的作用：① 让片段能「抓」到测序芯片表面；② 作为扩增和测序的起始点；③ 区分不同样本（加不同条码 = 可混合上机）。建库质量直接决定数据质量。机器不认识裸 DNA，得在每小段两端接上一段通用序列（接头），机器才能抓住它、识别它、扩增它。这套「加接头 + 扩增」的流程叫建库。

▎ 💡建库也是临床测序应用的核心部分

建库是整条链路里最吃手艺的环节。同样的样本，不同建库质量，出来的报告天差地别。这也是为什么我们筛应用合作方时，建库能力排第一。

4 信号太弱：复制成「簇」放大信号

图4 ｜ 单个分子信号太弱，复制成簇才拍得清

单个 DNA 信号太弱，相机拍不到 → 先扩增成「克隆簇」，单个片段；扩增成「簇」。当然这一步其实有很多方法，主流两种扩增方式：Illumina 用「桥式 PCR」在芯片表面长成簇；华大智造(DNBSEQ) 用滚环扩增做成「纳米球(DNB)」再上机。原理一样——都是为了把信号放大到能被相机拍到。

单个 DNA 分子发出的荧光信号太弱，机器拍不到。所以把每个片段复制成成千上万个一模一样的拷贝，聚成一个「簇」，信号才够亮。

▎ 💡信号放大的差异各有千秋

这一步（桥式 PCR / 克隆扩增）是 Illumina 路线的精髓，也是华大 DNBSEQ 用滚环扩增另辟蹊径的出发点。平台之间的差异，根子往往就在这。有油的，有电的，油电混动的，有球的，有桥的，球桥。。。

5 边合成边测序：一张张拍荧光照片

 图5 ｜ 每接一个荧光碱基就拍一张，读颜色即译序列，当然这里有双色荧光、四色荧光，也有单色荧光。illumina和MGI历史的专利纠纷就有涉及到双色荧光的。恰逢MGI互不诉讼公告发布3周年，Element 德国胜诉illumina，全球测序专利格局或迎来新拐点？

▎ 💡SBS仍是NGS的主流

所谓 SBS（边合成边测序）是所有短读长平台的共同语言。PacBio HiFi 本质是单分子实时合成测序（SMRT），无可逆终止子；Nanopore 是电信号纳米孔测序，完全不依赖荧光合成；二者均不属于 SBS 路线。

那是另一个故事，后面单独讲。

6 拼回去、找变异、出报告

 图6 ｜ 小片段拼回参考基因组，找变异，对应临床意义，找变异只是其中的一个情况，还有找：有没有、是不是、多多少、少多少等情况，后续有机会我们再讲。

几百万条短序列，比对回「参考基因组」（注意：GRCh37 (hg19)、GRCh38 (hg38) 坐标不互通，同一位点突变命名会出现差异，院内实验室必须固定单一版本，保障患者前后检测结果可比），找出不一样的地方，参考基因组（标准版），比如检测报告：EGFR L858R 突变（丰度 2.3%）→ 提示可用对应靶向药，单个片段的序列没意义，几百万条拼起来才有意义。通过比对参考基因组，找出「不一样」的位点（变异），再结合临床解读，生成你拿到的那份检测报告。

小片段测完后，用软件把它们比对回参考基因组，拼成完整序列，再找哪里跟标准版不一样（变异），最后对应到临床意义——能不能用药、用什么药。

▎ 📌 客户会问

报告上写的「变异」到底准不准？

▎ 💡准不准是一个系统的工程

报告不是「测」出来的，是「算 + 解读」出来的。前面任何一步偷工减料，到这里都会放大成误诊。这就是为什么我反复强调：别只看仪器品牌，看全链路。

▎ 本课核心观点

打断 → 建库 → 扩增 → 边合成边读 → 拼回比对 → 出报告

个人学习，仅供参考，欢迎大家交流。