一次性解决地贫检测，一种靶向长读长测序的单平台流程

传统长读长测序建库需要先扩增目标区域，再进行末端修复、dA加尾、barcode连接、纯化和测序接头连接。作者采用了OSLP一步法建库。引物设计阶段即整合barcode和target-binding区，在靶向PCR引物的5′端直接合成barcode序列，并进行5′磷酸化修饰。PCR完成后，扩增产物自带barcode，随后只需要进行纯化和连接即可进入纳米孔测序（下图A）。与barcoded long-PCR流程相比，OSLP可以减少2–3小时手动时间，并可大幅降低试剂成本。

OSLP-TGS-Nanopore的工作流程

图片来源：Clinical Chemistry

多重长片段PCR引物panel覆盖α珠蛋白基因簇和β珠蛋白基因簇，包含HBA2、HBA1、HBG2、HBG1、HBD和HBB的完整基因区域。Panel还包含了关键缺失位点的GAP-PCR引物，能识别α珠蛋白^--SEA、^--FIL、^--THAI等缺失，也能识别-α^3.7、-α^4.2、-α^2.4、αααanti^3.7、αααanti^4.2、HKαα等结构变异。β珠蛋白引物覆盖Chinese ^Gγ⁺(^Aγδβ)⁰ deletion、SEA-HPFH deletion、Taiwanese deletion、Hb anti-Lepore Hong Kong等变异，同时覆盖HBB等基因的SNV和indel（下图B）。

α-/β-珠蛋白引物位置和扩增子范围

图片来源：Clinical Chemistry

研究共纳入455份样本，分为验证队列和应用队列。验证队列中的样本已经通过传统方法充分表征，包括GAP-PCR、RDB、MLPA和Sanger测序，可用来评估OSLP-TGS-Nanopore的准确性。在验证队列中，作者对294份样本进行α珠蛋白基因分型，检测到8类结构变异和17类SNV/indel。对138份样本进行β珠蛋白基因分型，检测到4类结构变异和22类SNV/indel。结果显示，OSLP-TGS-Nanopore与传统方法达到100%一致。

作者还做了重复性验证。选择--SEA杂合缺失、ααα^anti3.7三联体、HBB:c.126_129delCTTT三个代表性变异，每个变异进行3个独立批次、每批3个重复，共27次重复，结果全部准确检出，批内和批间均无差异。这说明该方法具备较好的检测准确性和重复性。

作者还专门评估了OSLP-TGS-Nanopore在产前诊断中的应用。研究纳入61份产前DNA样本，包括5份脐血、23份绒毛和33份羊水样本。OSLP-TGS-Nanopore在这些产前样本中检出7类α珠蛋白结构变异、5类α珠蛋白SNV/indel、3类β珠蛋白结构变异和13类β珠蛋白SNV/indel，与传统方法达到100%一致。此外，还识别了3例反式复合杂合β珠蛋白变异。这说明该方法不仅适用于成人携带者筛查，也有潜力用于产前诊断。

长读长测序可直接跨越断点，显示结构变异的具体序列，比如测序结果显示了α珠蛋白区域多种结构变异，包括 --^THAI、--^SEA、-α^4.2、-α^3.7、-α^2.4、ααα^anti4.2、ααα^anti3.7和HKαα。这些变异表现为覆盖区域缺失、重复或融合结构，能够直观看到不同结构变异的读段模式（如下图）。作者还给出了部分结构变异的精确断点，例如--^THAI deletion为chr16:149863–183310，--^SEA deletion为chr16:165397–184700。β珠蛋白区域中，Chinese ^Gγ⁺(^Aγδβ)⁰ deletion、SEA-HPFH deletion、β^Taiwanese deletion和Hb anti-Lepore Hong Kong βδ hybrid等结构变异，也给出了相应断点范围。

长读长还能区分HBA1和HBA2同源区域。通过基因特异性引物和长读长比对，系统可以明确区分这些变异属于HBA1还是HBA2。

除此之外，长读长还可以判断顺式/反式构型。检出的HBA2:c.369C>G（α^WS）与HBA2:c.-15C>G（α^CAP+23） 位于同一等位基因上，而部分β珠蛋白变异位于反式。作者还展示了鉴定出的复合杂合变异，判断不同变异的构型关系，是否位于不同的等位基因上。这对产前诊断很重要。当父母均为携带者时，胎儿是否为重型地贫，常常取决于变异是否处于反式组合。

长读长鉴定出的α-血红蛋白的缺失和重复以及结构重排

图片来源：Clinical Chemistry

应用队列中，在100份做过GAP-PCR和RDB的α珠蛋白样本中，OSLP-TGS-Nanopore发现了9种额外α珠蛋白SNV，涉及16/100份样本。这些变异包括HBA2和HBA1中的多个罕见或非常规位点，例如 HBA2:c.263A>C、HBA2:c.142G>T、HBA1:c.34A>C、HBA1:c.223G>C 等，均经Sanger测序确认（图B-D）。在256份做过GAP-PCR和RDB的β珠蛋白样本中，系统发现8种额外β珠蛋白SNV，涉及33/256份样本，包括HBB:c.315+81C>T、HBB:c.315+180T>C、HBB:c.316-197C>T、HBB:c.113G>A、HBB:c.-100G>A、HBB:c.341T>A等，同样经Sanger验证。这说明，OSLP-TGS-Nanopore能发现传统GAP-PCR/RDB漏掉的额外变异。

复合杂合变异体的检测

图片来源：Clinical Chemistry

作者提出并验证了一种OSLP-TGS-Nanopore血红蛋白病检测方法，可同时检测α和β珠蛋白基因簇中的SNV、indel、大片段缺失、重复、融合和复杂结构变异，并可判断顺反式构型。它通过将barcode序列整合进靶向长片段PCR引物，避免传统长读长测序建库中的末端修复、dA加尾和barcode连接等步骤。该方法在294份α珠蛋白分型样本、138份β珠蛋白分型样本和61份产前样本均与传统方法达到100%一致。在应用队列中，OSLP-TGS-Nanopore还进一步发现常规GAP-PCR/RDB未覆盖的9种额外α珠蛋白SNV和8种额外β珠蛋白SNV。

这项研究也有一定的局限性。首先，这是一项回顾性验证研究，仍需要真实临床流程中的前瞻性评估。研究来自中国南方高发人群，其他地区可能需要根据本地人群变异谱扩展引物panel。其次，这是靶向方法，无法发现引物覆盖区域之外的变异。大规模筛查时，自动化建库、样本混样、质控阈值、报告标准和遗传咨询体系也仍需进一步完善。总之， OSLP-TGS-Nanopore通过一步法建库降低长读长测序门槛，再利用长读长跨越复杂区域，为地贫携带者筛查和产前诊断提供了一种更全面的技术框架。但最终是否能作为一线大规模筛查工具，还取决于样本通量、成本、自动化程度、结果解释体系和监管验证。