在肿瘤精准诊疗中，二代测序（NGS）已经成为识别驱动突变、指导靶向治疗、评估预后和判断免疫治疗相关生物标志物的重要工具。NGS鉴定生物标志物的准确性在很大程度上取决于组织和核酸的完整性。肿瘤NGS常用的组织来源包括新鲜组织、新鲜冷冻组织以及福尔马林固定石蜡包埋组织（FFPET）。FFPE样本保存方便、成本低、可长期室温保存，是病理科最常见的肿瘤分子检测材料。但与新鲜样本相比，FFPE处理会降低DNA产量，并引入DNA交联、脱嘌呤、脱氨基等损伤。如果进入NGS流程，就可能被误判为肿瘤突变，尤其是在低VAF区域更容易干扰判读。 近日，一组来自于约翰霍普金斯大学医学院及其他研究机构合作在杂志Clinical Chemistry上发表了一篇题为“Long-Term Storage of Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissues Negatively Impacts Next-Generation Sequencing: Successful Restoration with a DNA Repair Enzyme”的文章。作者系统评估了FFPE组织长期保存对杂交捕获NGS质量、变异检出和TMB评分的影响，并测试了DNA修复酶能否改善这些问题。结果显示，FFPE样本保存时间越长，DNA和测序质量越差。即使只保存2–4年，也会产生大量测序伪突变，并可导至TMB假性升高。DNA修复酶虽然不能明显恢复测序深度，但可以显著减少保存相关伪突变，并使TMB接近基线。这个结果对临床肿瘤NGS实验室、科研团队和伴随诊断开发都有重要的提示作用。
图片来源：Clinical Chemistry 主要内容 研究概述 研究包括了一个大样本回顾性队列以及一个配对实验队列。回顾性队列包括281例FFPE组织，保存时间为0–17年。实验队列中，研究者选取了10例FFPE肿瘤样本，在样本采集后1个月内提取DNA作为基线T0。同一FFPE块保存2年或4年后再次提取DNA，分别记为T2或T4。同时，保存后的DNA在建库前使用 NEBNext FFPE DNA Repair Mix进行DNA修复酶处理，记为T2E或T4E。之后使用同一个大型杂交捕获NGS panel检测432个癌症相关基因，比较真实变异、伪变异和TMB变化。
研究概述。图片来源：Clinical Chemistry FFPET保存超过5年后，可用于测序的高质量DNA明显下降 虽然初始输入DNA量相近，多数样本可以提供接近300ng DNA，但适合NGS建库的DNA量随保存时间明显下降。0–2年样本中，优化剪切后的gDNA中位量为219 ng，2–5年为212 ng，但5–7年下降到133 ng，7–11年下降到69 ng，11–17年为71 ng。保存7年后，可用于测序的DNA量只有0–5年样本的32%（图A）。 剪切后DNA片段长度反而随保存时间增加。0–2年样本中位剪切片段长度为269 bp，2年后增加到320–385 bp。但到了文库阶段，片段长度又变短。预杂交文库片段长度在0–2年为303 bp，2年后下降到249–277 bp。这说明长期保存样本在整个建库流程中经历了复杂损伤，前端因交联不易剪切，后续扩增和建库中又更容易产生短片段和低质量文库。
FFPET中，文库准备的QC指标。图片来源：Clinical Chemistry 测序质量也随保存时间下降 测序后的QC指标同样下降。结果显示，在0–2年样本中，平均测序插入片段长度为203 bp，2–5年降至150 bp，5–7年为143 bp，7–11年为129 bp，11–17年为125 bp。保存7年后，插入片段长度只有0–2年样本的63%（图A）。 平均唯一比对测序深度也明显下降。0–2年样本中位深度为1285×，2–5年为1045×，5–7年为753×，7–11年为505×，11–17年则降至228×。保存7年后，深度只有0–2年的39%，保存11年以上后，只有18%（图B）。即使输入剪切DNA量并不低，测序深度仍然很难达到高水平（图C）。
FFPET中基于测序的QC指标。图片来源：Clinical Chemistry FFPET保存2年以上就会产生大量伪突变，还会影响TMB评估 在实验队列的配对变异分析中，作者比较同一样本在基线、保存后未修复、保存后修复三种状态下的变异检出。结果显示，10个样本中共有154个一致性变异在各时间点都能检出，可视为真实变异背景。在保存后未修复样本中，额外出现了191个伪突变，只在保存后未处理样本中出现。真实一致性变异VAF较高，中位约38%，而伪突变VAF较低，中位约7%（图B和C）。这个结果表明，很多临床NGS panel使用的5% VAF阈值不能可靠过滤老旧FFPE样本中的伪突变。 FFPE伪突变中脱氨基型改变常见。一致性SNV中脱氨基改变占56%，而不一致伪SNV中脱氨基改变占68%。但伪突变范围远不止如此。在191个保存后未修复样本特有伪变异中，137个为SNV，占72%；54个为多核苷酸变异（MNV），占28%。MNV包括插入、缺失和复杂插入缺失变异。在一致性MNV中，插入变异占39%，而在伪MNV中，插入变异占83%。以上结果都说明长期保存FFPE导至的测序伪影既可能是SNV，也可能包括插入、缺失等复杂变异。 TMB是免疫治疗相关的重要聚合型基因组指标，特别容易受到伪突变影响。实验队列中，所有10个样本在基线均为 TMB-low，即≤10 mutations/Mb。但保存后未修复样本中，有4/10个样本出现TMB假性升高，TMB范围从18.46到65.06 mutations/Mb。这表明，TMB比单个热点突变更容易受到样本质量影响。对于老旧FFPE样本，TMB报告必须谨慎解释。
实验队列中的变异。图片来源：Clinical Chemistry DNA修复酶不能明显提高测序深度，但能明显减少伪突变 作者使用的DNA修复酶是NEBNext FFPE DNA Repair Mix。结果显示，修复酶对测序深度等常规QC指标改善并不明显，但对伪突变有明显作用。保存后未修复样本中的191个伪突变，在修复酶处理后大部分被消除，TMB也基本恢复到基线低TMB水平。并且，修复酶没有明显破坏真实临床相关变异的检出。研究中10个肿瘤样本共检出27个临床相关体细胞变异，包括TERT、EGFR、TP53、KRAS、NRAS、PIK3CA、APC、ARID1A等，这些重要变异在保存后和修复后基本仍可检出。 27个临床相关变异中，多数VAF变化小于10%，但也有部分变异VAF变化明显。例如一例肺腺癌中EGFR p.G719A从基线34.2%降至保存2年后的4.6%，修复后为4.8%，还有几例也是如此，发生VAF的下降。作者认为，这些VAF变化可能与肿瘤克隆结构、不同切片层面肿瘤含量变化、样本异质性和测序深度下降有关。 总结与讨论 作者证明了FFPE组织长期保存会降低DNA和测序质量，并在NGS中引入大量伪突变。这些伪突变不仅包括经典脱氨基SNV，也包括非脱氨基SNV和插入/缺失变异，并且伪突变可显著抬高TMB。DNA修复酶可明显减少这些伪突变，并基本恢复TMB评分。 但这个研究也有一定局限性。首先，修复酶实验队列只有10个样本，需要更大规模验证。其次，研究使用的是单一测序流程，结论是否完全适用于其他平台仍需进一步研究。DNA修复酶也不能解决所有问题，例如测序深度下降、肿瘤含量变化和切片层面异质性仍然存在。 总之，这篇文章给临床分子诊断实验室提供了一个现实的提醒，FFPE样本会随时间积累测序层面可见的DNA损伤。样本保存时间、DNA修复和NGS质控本身就是重要前分析变量，足以影响变异检出、VAF解释和TMB评分。 注：本文内容仅供行业动态参考，不构成任何投资建议或临床医疗决策依据。 |
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