tNGS：一步法如何实现

一些tNGS常用的方法是两步PCR扩增，现在很多厂家开始升级了，开始做一步法的，将多重PCR富集+建库，这两轮合并到一次PCR就可以做完。今天，分享下一篇专利文章：《一种扩增子文库的构建方法》，冰缘圣康医疗科技申请的，大家可以看看学习下。

这项专利的核心思路：让引物自己"长"出来

这项专利的关键词是"长引物"。

它没有分两管做两轮PCR，而是把两种引物——模板引物和接头引物——放进同一个PCR管里，让它们在同一个反应中分阶段完成两件事：

• 第一阶段
  ：接头引物拿模板引物当模板，把自己的3’端延伸出去，"长"成一条同时带有测序接头和特异性序列的长引物。
• 第二阶段
  ：这条长引物去扩增目标基因组，最终产物直接带着测序接头，纯化一下就是文库。

整个过程不需要开盖，不需要中间纯化，不需要片段筛选。

听起来简单，但要让这两件事在一管里按顺序发生、互不干扰，设计上有几个关键控制点。

技术拆解：四个关键设计

1. 模板引物3’端封闭——只当模板，不参赛

模板引物的结构是：特异性引物的反向互补序列 + 第一连接序列。

它的作用是在第一阶段给接头引物当模板。但有个问题：如果模板引物自己也能延伸，它就会去扩增目标基因组，跟长引物抢资源，甚至形成引物二聚体。

解决办法很直接——把模板引物的3’端封死。

封闭修饰的手段很多，专利里提到了ddC（双脱氧胞苷）、spacer C3、磷酸化（PHO）等。修饰之后，模板引物3’端没有游离羟基，DNA聚合酶没法往上加碱基，它就只能当模板，不能当引物。

这个设计的好处是双重的：一方面控制了模板引物不参与目标扩增，另一方面减少了二聚体的形成——因为模板引物没法延伸，就不会跟其他引物凑在一起瞎配。

2. 接头引物浓度 > 模板引物浓度——用"量"控方向

反应体系里同时有模板引物和接头引物，两者都能跟各自的模板结合。怎么保证第一阶段是"接头引物以模板引物为模板延伸"，而不是反过来乱来？

答案是浓度差。接头引物的总浓度要大于模板引物的总浓度。

模板引物量少，它在第一阶段被接头引物当模板用完后，随着循环进行逐渐被消耗掉；接头引物量多，保证它能充分结合模板引物完成长引物构建，同时在第二阶段有足够的长引物去扩增目标区域。

这个浓度比看似是个小细节，实际上是让整个反应按预定方向走的关键开关。

3. 单向扩增——只长一边，不长反义链

长引物构建阶段，接头引物以模板引物为模板进行延伸。这里有个容易踩坑的地方：如果双向都延伸，就会形成长引物的反义链，反义链又可能参与后续扩增，产生非特异产物。

专利的做法是让这个阶段做单向扩增。

模板引物3’端被封闭了，它自己不延伸，只能被接头引物当模板。接头引物延伸出来的长引物，3’端是特异性序列，5’端是测序接头序列。这条长引物不会反过来形成自己的反义链，因为它对应的模板（模板引物）已经被消耗、且不参与延伸。

单向扩增确保了长引物的"纯净性"——你构建出来的长引物就是你要的那条，没有杂链干扰后续步骤。

4. 两段式温度程序——用温度切阶段

两种引物在一管里，怎么让它们先构建长引物、再扩增目标？靠温度。

第一阶段（长引物构建）：退火温度高（63-75℃），时间短（10-30s），15-40个循环。

高温的好处是特异性高，接头引物只会跟模板引物精准配对，不会跟体系里大量的接头引物之间发生非特异结合。专利特别强调，温度低于50℃的话，接头引物之间可能发生非特异性扩增——因为接头引物浓度高，低温下容易"自配"。短时间延伸则限制了非特异产物的积累。

第二阶段（目标扩增）：退火温度低一些（50-65℃），时间长（退火1-5min，延伸0.5-2min），17-40个循环。

这时候体系里主要是长引物了，长引物的3’端是特异性序列，能跟目标基因组模板结合。退火时间长是为了让长引物和复杂基因组模板充分结合——毕竟基因组模板比模板引物复杂得多，配对需要更多时间。

两个阶段的温度参数差异，本质上是在一管反应里用物理条件划分了两个功能阶段。不需要加试剂、不需要换管，升温降温就切换了"工作模式"。

完整流程走一遍

把上面的设计拼起来，整个流程是这样的：

1. 合成引物
   ：设计模板引物（特异性序列的反向互补 + 连接序列），3’端做封闭修饰；设计接头引物（测序接头 + 连接序列，可带barcode）。
2. 一管配料
   ：模板引物、接头引物、聚合酶、buffer、模板DNA，全加到一个PCR管里。接头引物浓度 > 模板引物浓度。
3. 长引物构建
   ：95℃变性15s → 63-75℃退火延伸10-30s → 15-40个循环。接头引物以模板引物为模板单向延伸，生成携带测序接头的长引物。
4. 目标扩增
   ：95℃变性15s → 50-65℃退火1-5min → 72℃延伸0.5-2min → 17-40个循环。长引物3’端的特异性序列结合目标基因组，扩增富集。
5. 纯化
   ：PCR产物做磁珠纯化，去掉残留引物和二聚体，Qubit定量，完成。

如果文库浓度不够，还可以加一轮富集（95℃ 15s → 60℃退火延伸30s → 10个循环），再纯化。

全程不开盖。

效果怎么样？

专利里做了三个实验来验证：

• 实施例1
  ：人BRCA1/2基因多重PCR建库，20对引物，Illumina P5/P7接头。电泳条带300-400bp，亮度好，文库结构完整（P5 + index + 扩增子 + index + P7）。
• 实施例2
  ：4份全血混入7种标准菌株（单增李斯特菌、大肠杆菌、新生隐球菌等），做微生物鉴定建库。同样一步法搞定。
• 对比例
  ：传统两步法做同样的BRCA1/2建库。

结果对比，一步法的电泳条带亮度不输两步法，富集效果和灵敏度相当。也就是说，砍掉了开盖、纯化、筛选这些步骤，效果没有打折扣。

我的看法

这项技术最打动我的不是"省了几步操作"，而是它解决了一个实际场景中的核心矛盾：高通量平行建库时的交叉污染。

做低丰度微生物检测、做大panel多重PCR、做几十个样本平行建库的时候，两步法中间开盖纯化的污染风险是实打实的。一步法从源头上消除了这个问题——产物从一开始就带着标签，混不了。

而且它通用性好。换应用的时候，只需要换模板引物的特异性序列部分，接头引物不用动。做人基因组可以，做微生物可以，做RNA（先逆转录再建库）也行。不需要为每个应用重新设计整套引物体系。

从技术角度说，这项专利的设计逻辑是典型的"用引物工程替代流程操作"——不是去优化纯化步骤，而是通过引物结构和反应条件的巧妙设计，让本来需要两步完成的事情在一管里自动完成。这种思路在分子生物学工具开发里挺值得借鉴的。

当然，专利里没有给出测序数据深度、覆盖均匀性等更细节的指标，实际应用中长引物的扩增效率是否在所有位点都一致，多重PCR时不同引物对的效率差异怎么控制，这些还需要更多数据来回答。但作为一条技术路线，它的设计是自洽的，方向是对的。

对于做建库开发的人来说，这个思路值得收藏。

参考资料：CN 117587525 A《一种扩增子文库的构建方法》，河北冰缘圣康医疗科技有限公司，2024年2月23日公布。