多重PCR之主流平台（1）-多重荧光定量PCR技术

1988年Chamberlain首次提出多重 PCR的概念，随着生物技术的发展，多重PCR技术在扩增和检测方面已经取得了许多新的突破。在扩增方面，不再局限于在同一反应管中进行扩增，而是将不同的引物对和模板分散于相对独立的空间中进行扩增；在检测方面，不断有新的超多重检测技术的出现。文中从 多重PCR扩增与检测两方面概述了技术的发展及其应用，对影响扩增与检测效果的因素进行了总结。

一、多重荧光定量PCR技术

1.基于荧光探针的多重PCR 技术

多重荧光定量 PCR (Multiple fluorescencequantitative PCR)技术是在荧光定量 PCR 技术的基础上，利用几种不同荧光基团的组合，结合仪器对不同通道荧光的检测能力实现对多个靶标的实时定量检测。

TaqMan 水解探针 (Hydrolysisprobes) 是多重荧光 PCR 体系中常用的一种探针，探针一端标记荧光基团，另一端标记淬灭基团，通过在不同序列末端标记不同荧光基团及相应的淬灭基团，即可形成不同的 TaqMan 水解探针，将上述探针及相应的扩增引物加至同一反应体系，即可实现对多个靶标的共同检测。

探针的工作原理如下：

荧光基团及相应的淬灭基团如下：

分子信标 (Molecular beacon) 是多重 PCR 体系中另一种常用的探针，与一般荧光探针的区分主要是这个环茎型结构，该环部上的碱基序列是分子信标的识别部分，它能与靶基因自发地进行杂交。该茎部是一段4-12对碱基互补的发夹结构，在分子信标的5'端和3'端连接上荧光基团（Fluorophore）和淬灭基团（Quencher）。

分子信标的工作原理也与环茎型结构密不可分，处于茎部5’端的荧光基团与3’端的淬灭基团非常接近，通常距离小于10 nm，在该距离下会发生荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET) ，此时，荧光基团发出的荧光被淬灭基团吸收并以热的形式散发，因此不会检测到荧光信号。当分子信标探针处于PCR变性阶段，该探针的茎部打开，会与PCR体系中的特异性模板识别，复性阶段该探针与模板杂交，使得5'端荧光基团和3'端淬灭基团分离，此时荧光基团与淬灭基团距离变远，荧光基团发出的荧光不能被淬灭基团吸收,于是可检测到荧光信号。

2.基于探针编码的多重 PCR 技术

基于水解探针和分子信标探针的多重荧光定量 PCR 技术的优点是简便快捷，然而受仪器荧光检测通道的限制，往往最多只能达到四重或五重检测。

组合探针编码 (Combination probecoding) 技术的开发，使得目前的多重实时核酸扩增可检测的靶标数目多于仪器可检测的数目。通过对 4 种不同的荧光基团进行相互组合可以形成15 种指示探针 ，在多重反应体系中加入多种靶序列特异的置换探针 (Displacing probes)，那么在检测通道有限的情况下仍能够实现对多种不同的靶标同时进行扩增和检测。

3.基于荧光染料的多重 PCR 技术

非特异性的荧光染料嵌入到 DNA 双链小沟中后，在特定的激发光激发后将会产生一定波长的荧光。

以此为基础发展了熔解曲线 (Meltingcurve) 分析法，利用不同 DNA 序列具有不同 Tm(Melting temperature) 值的特征，在 PCR 反应结束后，通过程序升温使双链逐渐解链成单链，当达到双链特异的 Tm 值所对应的温度时，荧光强度大幅度降低，利用这样的原理可以对 PCR 中不同长度的双链产物或相同长度不同 GC 含量的双链进行分析。

针对不同的型别设计了特异性的引物对，从而对模板进行扩增生成不同的扩增子，扩增子之间T m 值各有差异，最后通过熔解曲线峰的位置进行鉴别。

在熔解曲线分析技术的基础上发展而来的高分辨率熔解曲线技术（详见一键解锁高分辨熔解曲线(HRM)的技术要点以及实验影响因素）是一种利用饱和染料，借助高分辨率的仪器，实现对单个核苷酸熔解温度不同从而形成不同形态熔解曲线，进而对基因进行分析的新技术，它具有极高的灵敏度，能够检测出单个碱基之间的差别，目前主要应用于单核苷酸多态性分析、甲基化分析、基因突变、基因分型等领域。

4.基于荧光探针熔解曲线的多重 PCR 技术

由于荧光基团本身发射的不是单一波长的荧光，而且 PCR 仪对不同荧光基团发射的荧光信号的区分度有限，所以现有的 PCR 仪只能检测 4–5 种不同的荧光信号。而基于荧光染料的多重 PCR 技术由于染料不具备特异性的识别能力，所以同一反应体系中通常只能使用一种荧光染料。为了弥补这两种方法的不足而开发出来的荧光探针熔解曲线技术 (Fluorescence probe melting curve technique)具有成本低、多重检测能力更强的优点。

荧光探针熔解曲线的多重 PCR 通过在靶序列中选取相对保守的区域设计通用扩增引物，然后在引物对之间选取差异度较大的区域设计能够识别各种目标核酸序列的特异性探针，探针在扩增的过程中不会被完全水解，并且根据检测通道的不同将探针进行分组，每个通道中包含多个特异性探针，通过调整探针的长度或 GC 含量对每条探针的 T m 值进行人为的调控，使得同一检测通道内针对不同靶标的检测探针 T m 值都间隔合适的差值，每个荧光通道均可定性检测多个靶标，最后通过熔解曲线进行分析。

具体步骤包括：

（1）多重PCR扩增

在一个反应体系中，多对引物特异性结合各自的目标序列，并在DNA聚合酶作用下同步扩增。为确保扩增效率，需精确设计各引物的退火温度及浓度。

（2）探针杂交与熔解曲线生成

扩增结束后，荧光探针与互补目标结合形成杂交体。随着温度逐步升高（如从40°C至85°C），杂交体逐渐解离。当解离发生时，荧光信号骤降，记录该过程生成特征性熔解曲线。

（3）探针特异性识别

不同探针与目标的杂交体具有不同的熔解温度（Tm），依据峰位和峰型可精确识别各目标，即使存在单碱基突变也能区分。

图：Taqman和分子信标探针在多重qPCR多重熔解曲线中的使用1。

A)TaqMan探针在低温水溶液中，未杂交探针因随机卷曲构象使荧光基团（F）与淬灭基团（Q）空间邻近而荧光微弱。与靶标杂交后探针呈现强荧光。当探针从靶标热解离（Δ）后，恢复弱荧光状态。

B)分子信标探针低温下未杂交探针因发夹结构导至淬灭效应而基本无荧光。与靶标杂交后呈现强荧光。靶标热解离后，未杂交探针形成类似TaqMan探针的随机卷曲构象，呈现弱荧光。

C)熔解曲线分析（上图：荧光强度F随温度T变化）经导数转换（-dF/dT）后形成熔解峰图（下图）