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[分享] Western Blot 概述

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发表于 2013-6-9 01:23:33 | 显示全部楼层 |阅读模式

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1979年,加利福尼亚大学医学院J.Renart, J.Reiser和G.R.Stark一起发表了一篇题为“Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure”的文章(【华为网盘】 WB.pdf),文章报道了将蛋白质通过凝胶电泳进行分享然后再转移到重氮甲氧基纤维素纸上,蛋白质与重氮甲氧基纤维素纸发生共价结合而固定,然后再用抗血清与之温育,再用同位素标记的Protein A与之结合,最后检测到的蛋白质通过同位素的自显影信号而展现出来,这便是最早期的蛋白质印迹技术。由于此前Edwin Southern 发明了DNA杂交技术,也就是Southern Blot,另外James Alwine,David Kemp和George Stark(也就是上前那篇文章的作者之一)则发明了RNA杂交技术,也就是众所周知的Northern Blot,于是在1981年,W. Neal Burnette在《Analytical Biochemistry》一书中将前述文章中发明的蛋白质印迹技术称为Western Blot技术,从此Western Blot这个名字沿用至今。

    在今天,几乎每一个进行蛋白质研究的实验室都进行过Western Blot,尤其是商品化的电泳及电转设备、商品化的抗体和信号检测系统、多种技术进步共同提高检测的灵敏度,使得Western blot技术在30后的今天仍然光彩熠熠。在一般的实验室,Western blot常被用来检测目标蛋白是否在重组的菌或者转染的细胞中是否表达,在天然组织或者培养的肿瘤细胞中是否表达,表达的相对水平以及表达出来的蛋白质的形式是否有所变化等。有人可能会说,这些事情我都可以用质谱分析来进行啊。是的,在今天质谱的使用确实非常广泛,它不仅可以分析蛋白质的相对表达水平,甚至还可以分析出蛋白质的修饰(在Western blot中修饰过的蛋白质和未被修饰过的蛋白质可能需要两份甚至更多份不同的抗体进行鉴定),而且质谱分析需要的样品更少,检测下限更低,所以不少人喜欢用质谱来分析。但是Western Blot也有其不可替代的优点:(1)Western Blot所需要的设备方便,成本低,使用灵活。Western Blot所有设备用下来也只需要一两万块钱足矣,但是质谱仪的价格至少都是数百万元。有人说“我自己买不起设备,那我送到别人公司去做也很便宜啊”,站长可以告诉你,一般的公司做质谱一般价格都在1000元人民币/样品以上,但是做Western Blot的服务一般在100元/泳道,甚至更低。(2)对于熟练的人来说,Western Blot结果一般比较稳定,而且阳性结果一般非常可靠,但是质谱分析的结果假阳性的概率很大。(3)Western Blot的结果分析比质谱容易,这个就不用多说了,western blot的结果只是看看条带出现的情况,但是质谱分析还需要根据得分来判断结果的可靠性。

    好了,背景就说到这里了,下面简单地叙述一下现代Western Blot基本原理和过程,详细的步骤与流程将在各个分节独立介绍。

    Western Blot的主要目的是检测样本(组织或细胞)中某种蛋白质(即靶蛋白)是否表达以及表达的相对丰度的一种技术手段。Western Blot第一步是将培养的细胞或者天然的组织进行裂解,尽可能释放出所有的蛋白至液相,再利用现在比较成熟的SDS-PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis,聚丙烯酰胺凝胶电泳)将样品中的蛋白质依照各自的分子量进行分离,然后同样在电场的作用下将凝胶中分离的蛋白质转移到支持物上(通常是膜上),然后加入能特定识别靶蛋白的抗体(即一抗)使之形成复合物,再用标记过的二抗(能与一抗结合的抗体)与此复合物结合,形成靶蛋白-一抗-二抗复合物,最后二抗上的标记物通过自发光或者催化底物发光或催化底物形成沉淀而将结果展示出来,Western Blot整个过程可以用如下的图来表示(不日站长将制备动画版)。

WB.jpg

Western Blot操作步骤与原理图(点击图片可查看高清大图)

    Western Blot的原理看起来比较简单,而且它的发明者在第一次WB的时候就把流程建立得很完善,因此实验人员只需要多加思考就可以把它做好。另外,在这30多年的发展中,原始的Western Blot也有不少改进(如第一次WB使用的膜与蛋白质以共价键结合,但是现在的膜基本上都以非共价键结合,再如第一次WB使用的检测系统是放射性标记的Protein A,但现在用的基本上都是酶标二抗),使得WB过程变得可控性更好,也更加稳定和安全,因此初学者不必要有畏难的心理。




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