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[讨论] 免疫印迹技术的特殊常见问题处理

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发表于 2015-3-2 18:59:08 | 显示全部楼层 |阅读模式

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一、免疫印迹检测酪氨酸残基的磷酸化


     由于针对磷酸化酪氨酸残基的特异性抗体已经制备成功并商品化,因此可用于检测印迹膜上蛋白质中磷酸化的酪氨酸。目前已有特异针对磷酸化丝氨酸和磷酸化苏氨酸抗体的首次报道(Zymed)。如果这些抗体被证明是特异的,实验者将可用于检测蛋白质中所有的3种磷酸化的残基。


     检测磷酸化酪氨酸残基采用直接法。在完成印迹膜转印及封闭后,用抗磷酸化酪氨酸残基的抗体检测并用标准方法进行处理。该方法特别适合于在免疫印迹之前用免疫沉淀方法收集的待研究抗原。方法的特异性非常好并可确证所检测的条带是磷酸化的。


    二、剥离与重复免疫印迹


     许多学者正着手研究剥离免疫印迹法(strippingimmunoblots),并在同一印迹膜上重复检测多种蛋白质。这是一种在相同条件下检测2种抗原的好方法。然而,该方法不能用于任何定量比较。


     如果需要剥离免疫印迹,任何能阻断抗体/抗原相互作用的方法都是有用的。建议用于剥离免疫印迹的处理方法是用2%SDS、50mmol/LDTT溶于50retool/LTris—HCl,pH7.0,于70℃处理30min,然后用中性缓冲液如PBS清洗数次。如果需要将印迹物剥离并重复检测,只要印迹膜不是用于抗磷酸化酪氨酸抗体,在剥离免疫印迹之前要用5%脱脂奶粉进行封闭。尽管目前对其机制尚不完全清楚,用牛奶作为阻断液使结合的抗体解离是最有效的。在剥离和重复检测之前,印迹膜必须再次封闭,因此,须从第一步开始做起。


     这些剥离的条件比较苛刻,很可能有些抗原会从膜上丢失。因此,该方法仅仅在某些特定的条件下才使用。将抗原结合在硝酸纤维素或尼龙膜上的结合键是非共价键,因而将抗体从抗原上剥离的各种方法也将一些多肽从膜上移去。因此,这些方法不能用于定量也不能就此断定某种抗原不存在。但在某些情况下,它可用来证实另一种抗原的存在,因此,在这种情况下,剥离和重复检测免疫印迹法就很有效。当一个保存的印迹膜需用于检测一种新发现的蛋白质是否存在,而当初在处理原始样品时尚不知道,此时剥离免疫印迹就是一种有效的方法。然而,对于新鲜样品来说,其他有效方法可以证实在相同的原始样品中有多种抗原存在。最好的方法是直接制备双份印迹膜,并分别检测不同的蛋白质。当待研究抗原的分子量不相同时,可将印迹膜剪成多个部分单独进行检测。有关在转印后如何定位条带和剪切印迹膜的方法详见“转印后切取印迹”部分。


     印迹膜用水清洗并使其干燥或用PBS清洗后放入塑料袋中置4℃保存。


     三、免疫印迹纯化抗体


     通过对免疫印迹技术进行简单的改进就可将结合于某一多肽条带的抗体从多克隆血清中纯化出来(Olmstedl981;Smith和Fisherl984)。这些条带特异性抗体尽管获得量很少,但在研究复杂抗原时非常有用,常常可以对抗原的同一性进行证实。对于可以较大量获得的抗原,例如,从细菌超常表达系统中分离抗原,可以相应地产生大量的抗原特异性抗体。


     这种方法是将抗原加入一个大的制备性样孔中。按常法进行凝胶电泳,转印和加入一抗。从一侧面剪下印迹膜条测定与抗体结合的抗原位置,按通常处理进行抗原检测。抗原—抗体复合物在边条中定位后,将印迹膜未处理的部分和边条排列在一起。用锋利的解剖刀将含有抗原和一抗的部分切下。将这些部分剪成小块放入试管中。用100mmol/L的甘氨酸(pH2.5)孵育10min或3mol/L硫氢化钾作用10min。除去洗脱缓冲液并用1/10体积的1mol/LTris(pH8.0)对甘氨酸洗脱液进行中和,硫氢化钾洗脱液则用10倍体积的PBS进行稀释。(转自:实验室前沿)


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