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[分享] Western blotting知识问答

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发表于 2015-1-8 08:28:34 | 显示全部楼层 |阅读模式

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  Western Blotting一般用于什么样的实验?

  Western blotting是一个用于蛋白质分析的常规技术,它可以从蛋白混合物中检测出目标蛋白,从而半定量或定性(无法绝对定量)的确定正常或实验条件下细胞或组织中目标蛋白的表达情况。

  另外,Western blotting还可用于蛋白-蛋白、蛋白-DNA和蛋白-RNA相互作用的后续分析,并结合组分分离技术,检测目标蛋白的定位情况,成为免疫荧光实验的补充。同时,在后基因组时代,随着质谱和蛋白质芯片等技术的不断完善,作为一种廉价、便捷、可靠的研究工具,Western blotting将与其他技术一起相互配合,发挥更重要的作用。

  Western Blotting的实验结果如何优化?

  Western Blotting由于实验步骤较多,每一步操作都会对最终结果产生影响。

  样品制备时,样品量多少非常重要,如果目标蛋白的绝对量较少,则需通过组分分离、IP等方法进行富集;上样量应适中,过多会导至信号过强,分辨率降低,过少会导至信号过弱。

  电泳时,应选择合适的胶浓度和电压电流参数,确保蛋白有效分离,条带清晰整齐。

  转膜时,应根据蛋白大小,选择合适的转膜体系及电流参数和时间,通过调整缓冲液成分,提高转膜效率及蛋白与膜的结合力。

  封闭时,应根据实际情况,选择合适的封闭物和缓冲液,以及封闭液浓度和封闭时间,以降低非特异性反应,达到最高的信噪比。

  选择抗体时,有条件的话可以尝试多种抗体(单抗、多抗,甚至可以使用多种抗体联用),不同的稀释比例、反应温度和时间,以确定一个最佳的组合。

  显色时,可以尝试不同灵敏度的显色液以及信号采集系统,力争获得分辨率、对比度和区分度最佳的结果。

  如何较好地设置Western内参?

  内参即是内部参照,对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白,它们在各组织和细胞中的表达相对恒定,在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。其作用是校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差,保证实验结果的准确性。

  在WesternBlotting中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参,这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达,由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定,借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差,这样半定量的结果才更为可信。 此外使用内参可以作为空白对照,检测蛋白转膜情况是否完全、整个WesternBlotting显色或者发光体系是否正常。

  常用的蛋白质内参有GAPDH和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。一般要选择一个在处理因素作用的条件下蛋白含量不会发生改变的蛋白作内参。为了让实验更加严谨有说服力都要设计对照实验,对照分为:阳性对照(最好有标准品(比如β-actin、GAPDH)或阳性血清);阴性对照(测血时用相应小鼠未免疫血清(即正常血);空白对照(不加一抗,用PBS代替);无关对照(用无关抗体)。

  我该选择什么样的抗体?

  由于抗体公司及种类繁多,针对同一种蛋白常常会有多种不同的抗体。首先应根据自己的实验需要(WB,IF,IP,IHC等)进行筛选,不同实验目的的抗体有时无法通用(参照抗体说明书);其次,可以参照已发表文献中所用抗体,或向已用实验者进行征询;另外,针对单克隆和多克隆抗体,可根据一下标准进行选择;如果目标蛋白无相应的商业化抗体,或商业化抗体效果均不佳,可考虑寻找合适的抗体公司进行定制。

多克隆抗体

单克隆抗体

单克隆抗体群(由一个免疫原产生的多个单克隆抗体混合物)

抗体抗原作用信号强度

极佳

由抗体的亲和力决定(极佳或者极弱)

极佳

特异性

通常很好,但有时会有非特异性相互作用

极佳,但有时会有交叉反应

极佳(由于选择可以进行IP且没有交叉反应的抗体组成单克隆抗体群)

优点

亲和力高(由于抗体可以与目的蛋白的多个抗原决定蔟相互作用)

特异性好,且可以无限量供应

特异性好,亲和力高(由于选择可以进行IP且没有交叉反应的抗体组成单克隆抗体群)

缺点

非特异性相互作用很难去除

需要筛选亲和力高的抗体;抗原表位可能会被相互作用蛋白遮蔽

能够筛选得到的符合条件的单克隆并不多,所以单克隆抗体群也就不容易获得

免疫沉淀效果

极佳(由于亲和力高)

由抗体的亲和力决定(极佳或者极弱)

极佳(由于选择可以进行IP且没有交叉反应的抗体组成单克隆抗体群)

免疫共沉淀效果

通常很好,但有时非特异性相互作用会带来假阳性

由抗体的亲和力决定和抗原表位是否被相互作用蛋白遮蔽决定(极佳或者极弱)

极佳(由于选择可以成功进行IP且没有交叉反应的抗体组成单克隆抗体群)

染色质免疫沉淀效果

通常很好,但有时非特异性相互作用会带来假阳性

由抗体的亲和力决定和抗原表位是否被遮蔽或者以及抗原表位是否被交联实验所破坏决定(极佳或者极弱)

极佳(由于选择可以成功进行IP且没有交叉反应的抗体组成单克隆抗体群)




来源:中生网

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