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Illumina诊断企业发展史(IVD业内人士必读)第七篇

2016-12-2 00:00| 编辑: 小桔灯网| 查看: 5096| 评论: 0|来源: 医疗干货群

摘要: 今天推出《11大IVD巨头企业发展史汇编》系列第七篇——— Illumina 1公司概况 在测序行业,Illumina公司就像是IT界中的Google一样,无人不知。事实上,它们的声名和影响力早已超出基因测序行业,它经常出现在各大 ...
今天推出《11大IVD巨头企业发展史汇编》系列第七篇——— Illumina

1
公司概况

在测序行业,Illumina公司就像是IT界中的Google一样,无人不知。事实上,它们的声名和影响力早已超出基因测序行业,它经常出现在各大榜单显著位置。2014年2月,它又被美国麻省理工《科技创业》杂志(MIT Technology Review)选出2014全球最聪明的50家公司(50 Smartest Companies)中榜首,将谷歌、苹果等诸多互联网巨头公司远远甩在身后。

Illumina公司产品线介绍

Illumina公司的产品线主要分为三大类,高通量生物芯片检测仪,高通量测序仪及定量PCR仪。

高通量生物芯片技术是Illumina公司成长的第一个里程碑,在人类基因组计划完成后,生命科学研究进入后基因组时代,对于SNP的研究成了基因功能研究 的主要技术手段,国际上也有了专门针对SNP研究的Hapmap计划,而Illumina公司的高通量芯片称为Hapmap计划的主要技术平台,所有 Hapmap的数据,80%以上都来自于Illumina的高通量芯片平台,全世界科学家选择Illumina芯片平台的主要原因也在于此。

高通量测序仪可谓是Illumina最大的产品线,高通量测序技术的出现和发展可以说是近五年时间内生命科学领域最具有革命性发展的技术之一,它极大的加速 了整个科学研究的进程,也改变了应用领域和临床研究及诊断的思路。目前,公司主打产品有MiSeq测序仪、HiSeq X Ten测序仪、Miseq FGx测序仪、NextSeq 500/550桌上型测序仪、MiniSeq台式测序仪等等。

定量PCR仪Eco,是Illumina公司在2010年收购另外一个定量PCR仪厂家而扩增的产品线。定量PCR仪是目前分子生物学实验中常用的核苷酸检测设备,已经被广泛应用于生命科学领域的各个方面,包括新药开发研究、药物疗效研究、药物预后指标研究等等。

Illumina公司发展历史

Illumina是 由David Walt博士、CW 集团的Larry Bock、兽医学博士John Stuelpnagel、 Anthony Czarnik博士及Mark Chee博士于1998年4月共同组建。在与CW 集团风险投资公司合作期间,Larry和John在Tufts大学研究出了BeadArray技术,经过商议他们取得了该技术的专属授权。他们把 Illumina的总部设于加利福尼亚的圣地亚哥,并于2000年7月首次公开上市。

Illumina于2001年开始提供SNP基因分型服务,并于一年后利用GoldenGate基因分型技术推出首个Illumina BeadLab系统。目前,Illumina针对日益成熟的基因序列分析市场,提供基于微阵列技术的产品和服务。

  • 1998年4月1日: Illumina 公司成立

Illumina由David Walt博士(Tufts University,BeadArray技术投资者)、Larry Bock(CW Group)、John Stuelpnagel、D.V.M.、Anthony Czarnik博士及Mark Chee博士创立。

  • 1998年11月1日: 公司总体框架形成

Illumina成立时有7名员工,启动资金为860万美元,在加州圣迭戈10,000平方英尺的厂房内开始研发核心技术和知识产权产品。

  • 2008年1月4日: 宣布公司重组

Illumina重组了经营结构,以便进一步利用测序和基因分型业务的协同优势。

  • 2008年1月7日: 推出高密度产品线

Infinium HD Human1M-Duo(两个样品/芯片)和Human610-Quad(四个样品/芯片)特有每张BeadChip芯片上多达230万个单核苷酸多态性(SNP),让样品通量加倍,而DNA起始量降低了70%。

  • 2008年1月15日: 发行Infinium BovineSNP50 芯片

Infinium BovineSNP50 BeadChip芯片是一个12个样品的基因分型产品,特有54,000个SNP,能检测任何牛品种的基因变异。

  • 2008年2月6日: Illumina测出第一个非洲人基因组的序列

Illumina的科学家利用Genome Analyzer对一名匿名的非洲男性(来自尼日利亚的约鲁巴人)的基因组进行了测序。这项成果确立了Illumina测序技术在准确测序大且复杂的基因组上的直接作用。

2
收并购介绍

2006年11月1日: 收购Solexa。Solexa公司的基因测序技术非常新颖,它采用综合的方法进行测序,比其他公司的技术快100倍,而且价格更低。2006年,Solexa的年收入只有250万美元,是一家规模很小的公司。Illumina收购了Solexa之后,为其提供了全球销售网络,“第一年我们的收入就达到了1亿美元,这就是Illumina的转折点。从此我们开始极速发展。”Solexa的加入也是Illumina其他竞争对手的转折点,这使他们在技术层面上立刻被拖后。

2012年9月,Illumina收购英国的遗传变异测序服务公司Blue Gnome;2013年1月,收购了Verinata Health公司。Verinata Health公司在产前血液测试领域具有最宝贵的知识产权;2014年7月,继续收购一家专注于伴随诊断及其他IVD的咨询公司Myraqa;同年,Illumina联合多个癌症研究中心,宣布成立AGC(规范基因组联盟)联合机构,指导下一代测序技术在肿瘤临床诊断中的应用。

3
营收情况

Illumina公司2006-2015年度营收情况

净销售额:(单位:百万美元)

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近10年来都处于持续增长,并且平均保持在20%左右的增长率。

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销货成本

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从上表可以看出,Illumina公司销货成本处于30%-40%,并处于下降趋势,在往30%点靠近;以此能推出Illumina公司销货成本的增加在于业务销售量的增长。

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毛利

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毛利是销货成本的对立面,基本上保持在65%并向70%靠近。

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净收入

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净收入大体保持稳定且增长的趋势,长期效率偏好。

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研发费用

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研发费用的增加,表明Illumina会有一定新产品的产出,但同时所占比例又慢慢控制在20%以内。

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一般销售及行政费用

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行政费用整体增长,但所占比大概在25%-30%;

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总结

Illumina从1998年4月1日成立,启动资金为860万美元;于2000年7月1日股票首次公开招募筹得超过1亿美元;直至2007年1月公布了五年内首次盈利的12个月;此后便踏上业务不断增长的时期。各成本比例一直控制得相对比较均衡稳定,在不算非营收部分的情况下,基本有20%左右的净收入,效益良好。

年度财务统计见文末附表。

4
业务构成

从客户分布的情况看,美国占了55%,欧洲,中东和非洲占了25%,亚太占了21%,日本占了8%。

从客户种类的分布增速看政府和学术机构是最大头,过去五年的复合增长率为14%。商业用途排名第二,但增长最快,过去五年的复合增长率34%。医院占比还是很小,过去五年复合增长率24%。非营利组织过去五年复合增长率13%。

具体业务方面,商业用途又细分为产前诊断,制药业,商用分子诊断以及服务业等方面。

5
主要仪器产品介绍

HiSeq2000是Illumina公司于2010年推出的新款测序仪,测序原理与Genome Analyzer相同,采用稳定的可逆终止法边合成边测序技术。该技术使用4种含有末端阻断基团和不同荧光信号的碱基进行模板互补链合成,不仅确保了测序的高精确性和高顺序性,而且排除了由重复序列和同聚物导至的测序错误。与Genome Analyzer不同的是,HiSeq2000融合了最新的光学系统和制造工艺,采用2个激光源对Flow Cell扫描,用4台照相机对4种碱基分别进行记录,减少了不同碱基间的信号干扰,提高了测序准确度。HiSeq2000因采用了Flow Cell双表面成像技术,增加了Flow Cell有效面积,从而增大了测序通量,降低了测序成本。

HiSeq2500是Illumina于2012年推出的HiSeq2000测序仪的升级版。HiSeq2500与HiSeq2000相比,有两种测序模式:High Output模式和Rapid 模式。High Output模式与现在的HiSeq2000测序模式相同,测序所用Flow Cell和测序试剂无改变;Rapid模式采用全新Flow Cell及测序试剂,缩短了测序时间,测序读长可达150bp。

Illumina Miseq是2011年2月推出的新一代小型化(bench-top)测序仪,这款仪器使用了Illumina TruSeq可逆中止碱基边合成边测序的化学方法,与HiSeq 2000相比,虽然每个Run的测序通量很低,但是久经考验的新一代测序试剂带来无可比拟的准确性,结合上全新的流体系统,使得一个测序循环时间缩短了8倍以上。

2014年在第32届摩根大通保健大会上重磅推出两款测序仪:HiSeq X Ten和NextSeq 500。HiSeq X Ten定位为工厂规模的测序仪,通量超高,价格不菲;而NextSeq 500则旨在以MiSeq的大小提供HiSeq的性能。

NextSeq 500系统集高通量测序的性能和台式测序仪的简约为一体,是目前唯一一款可实现外显子组、转录组和全基因组测序的台式测序仪。它可在两种模式下开展测序实 验:高产量(High Output)和中等产量(Medium Output),在单次运行中可获得20-120 Gb的数据。

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策略简介

布局测序产业中下游

Illumina 公司一直引领者测序行业的发展,对测序行业的控制,主要是它牢牢地掌握着测序行业的源头,开凿蓄水均由它来掌控。市场上60%左右的测序仪是 Illumina公司生产的,尽管它已经感受到了拥有强大后盾的Life Tech公司的竞争压力,但这种在测序行业处于主导位置的局面还会持续一段时间。

Illumina希望自己并不仅仅是一家测序仪制造商。 2012年9月,Illumina就收购了英国的遗传变异测序服务公司BlueGnome。Illumina的一系列的动作都彰显了Illumina希望 凭借自己在测序技术上的优势快速进入DNA测序临床应用领域的意图。今年7月下旬,Illumina收购了一家专注于伴随诊断及其他IVD的咨询公司 Myraqa,此外,Illumina今年表示,它正在开发供FDA批准的肿瘤panel,它计划在2014年底向FDA提交基于HiSeq2500的 Verifi无创产前检测,以获得体外诊断的许可。布局基因测序行业中下游已初见端倪。

这种情况或许让那些已购买过Illumina昂贵的测序仪公司最为头疼。它们潜心孵化出来的市场很容易被Illumina抢走。而这些测序服务公司唯一的出路就是优化和提供优质的服务和多元化业务组合。

很多人知道个人基因组测序是未来测序行业中一块很大的蛋糕,23andme、foundation medicine等公司目前正在潜心孵化这方面的市场,而这一市场也陆陆续续进入更多的公司。Illumina会不会进入这一领域呢?毋庸置疑,Illumina会涉足这一领域。目前这一领域的市场并没有培养起来,加上这些公司的影响力还没有到不足以撼动的程度,所以Illumina公司暂时 还没有发力进入这一领域,但它会在适当的时机会选择进入个人基因测序服务市场,因为这块市场是未来增长最快,也是最具有潜力的。事实上,Illumina公司在这一领域也有些动作,如最近Illumina公司开始着眼于消费产品领域,计划开发出一款可直接插入智能手机中的芯片,智能手机将成为“分子听诊器”,从而带来个人化的基因医疗。

统领测序行业全局

除此之外,Illumina公司还想 掌控整个测序行业全局。2014年上半年,Illumina公司推出世界首个基因组学孵化器,该孵化期用于为基因组学产业营造一个创新的生态系统。孵化器 项目将致力于为企业家加快上市时间,减少入市壁垒,并为一些从事科学和商业前景新一代测序 (NGS)应用的新创企业提供援助。除为创新公司提供资金、技术之外,还将提供辅导、全球客户资源、创新网络、合作伙伴支持等一系列的支持,以帮助创新公 司的成长。

另外,在个人遗传信息咨询,个人遗传信息存储以及生物遗传信息挖掘方面,Illumina公司也大有所为。

Illumina公司市场表现

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二代基因测序仪市场份额

自从2007年初,Illumina收购了基因测序公司Solexa,才算真正进入DNA测序市场,从08年到现在,过去10年,股价翻了10倍。Illumina在过去5年中,收入端复合增长率23%,EPS复合增长率28%,除了占据市场份额第一的测序业务,Illumina还有14%的收入来自测序服务。

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常见基因测序应用领域

基因测序目前可应用于医疗领域和非医疗领域。

医疗领域的应用领域主要有生殖健康、遗传病检测、新药研发、肿瘤诊断及治疗、心血管疾病以及医学基础研究,其中生殖健康、肿瘤诊断及治疗、新药研发和医学基础研究是目前最主要的应用领域。基因测序在非医疗领域的应用主要有环境污染治理、生物多样性保护、食品及中药材同源鉴定、农牧业育种及司法鉴定。

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Illumina公司主要是二代测序产品,因此在此重点搜集NGS临床相关应用:包括1、妇幼与生殖健康;2、肿瘤分子诊断及个体化用药;3、遗传性疾病;4、药物基因组学。

1、妇幼与生殖健康

  • 一级预防:孕前预防(PGD/PGS(Preimplantation Genetic Diagnosis/Screening)


胚胎植入前遗传学诊断/筛查技术,进行试管婴儿技术助孕时,在胚胎移植之前,对早期胚胎进行染色体非整倍体、非平衡易位和单基因疾病检测,以期挑选染色体正常的胚胎植入子宫,提高患者的临床妊娠率、降低流产率。与传统依赖显微镜技术挑选形态学等级高的胚胎进行移植的胚胎形态学相比:PGS可直接对胚胎的遗传物质进行分析;对早期胚胎进行染色体数目和结构异常的检测;

据统计,我国平均每8对夫妻中就有一对遭遇生育困境,而且不能生育的夫妻呈年轻化趋势,25岁至30岁的患者居多。目前,中国不孕不育患者已超过4000万,占育龄人口的12.5%。据统计,在中国每年约有10万试管婴儿出生。在我国,需要辅助生殖助孕的育龄妇女大约有400万左右。

  • PGS临床流程:


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检测内容:全部染色体非整倍体;大于4Mb的新发的染色体微缺失/微重复;大于1Mb的遗传自父母的染色体微缺失/微重复。

使用范围: 高龄患者(≧35岁); 有反复流产史的患者(自然流产≧3次); 反复胚胎种植失败的患者(失败≧3次);生育过染色体异常患儿的夫妇;自身染色体数目或结构异常的夫妇;严重的男性不育(SMF),少弱精子症、 畸精症;自愿接受胚胎染色体异常排查的夫妇。

  • 二级预防:产前筛查、诊断(NIPT 无创产前检测 Non-invasive Prenatal Testing)


一项应用于临床检测的基因组新技术,NIPT主要是通过孕期母体的外周血,对其中的游离DNA、 RNA(含有胎儿来源的DNA、 RNA)进行测序,来判断胎儿是否患有某些遗传病,如21-三体综合征、 18三体综合征以及13-三体综合征。

NIPT的基本原理:针对孕妇外周血浆中,主要来自孕妇自身组织细胞,少部分来自胎盘滋养层细胞经过凋亡(apoptosis)后形成的不完整的游离DNA片段(平均50~200碱基);在NGS仪器内比对已经建立的以36碱基为基本的庞大核苷酸序列资料库,利用大规模并行测序方式进行辨识,将其分门别类后,累计加总,计算出不同染色体位置来源的DNA片段出现数目或频率(不分辨DNA片段来自孕妇或胎盘);再以逻辑统计方式,分析出特定染色体来源的DNA片段是否超标。利用目前较普遍被使用的分析程式得出的Z值(Z score)超过3;或标准化染色体值(normalized chromosomevalues, NCVs)超过4即被认定为染色体非整倍体(aneuploidy)。
NIPT检出率:21三体综合征〉 99%
18三体综合征〉 97%
13三体综合征〉 90%
NIPT假阳性率:复合假阳性率不高于0.5%
NIPT阳性预测值:复合阳性预测值不低于50%
NIPT假阴性率:复合假阴性率约为0.3%
NIPT适应人群:
  • 所有希望排除胎儿染色体非整倍性疾病的孕妇;
  • 孕早、中期血清筛查高危的孕妇;
  • 夫妇一方为染色体病患者,或曾妊娠、生育过染色体病患儿的孕妇;
  • 有不明原因自然流产史、畸胎史、死胎或死产史的孕妇;
  • 有异常胎儿超声波检查结果者 ( NT、鼻梁高度 ) ;
  • 夫妇一方有致畸物质接触史。


  • 三级预防:生后, NGS与新生儿基因筛查


  • 对象:

具有家族遗传病史的新生儿;
新妈妈年龄在35岁以上的新生儿;
具有家族遗传病史的新生儿;
父母长期接触有害放射线或农药的新生儿。

  • 目的:使出生缺陷得到治疗和控制


全球出生缺陷平均比例高达6%,每年新增790万出生缺陷婴儿。中国:我国出生缺陷高达5.6%,每年新增90万先天缺陷婴儿。其中基因遗传导至的出生缺陷约占25%。

  • 技术原理: 通过采集新生婴儿出生24小时以后的足跟血提取DNA进行检测和分析,对新生儿常见遗传病患病风险和儿童药物敏感性进行评估和提示。


新生儿基因检测采用目标区域捕获技术针对基因组DNA中的目标区域进行高通量测序和生物信息分析,检测区域覆盖度达95%以上,准确性高达99%。

  • 流程:通过采集新生儿出生24小时后的足跟血提取DNA;利用高通量测序技术和信息分析平台进行检测和分析;对新生儿常见遗传病患病风险和儿童药物敏感基因进行评估和提示。


  • 优势:早发现、早诊断、早治疗,避免因诊治延误而造成患儿不可逆的损伤;了解新生儿致病突变基因携带情况,为新生儿提供生育指导;指导儿童科学用药,避免用药不当产生的不良反应。


2、肿瘤分子诊断及个体化用药:

肿瘤诊断治疗应用为基因测序最具潜力的应用市场。

肿瘤是机体在各种致癌因素作用下,局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长的控制增生所形成的新生物。 《 2014 年世界癌症报告》 数据显示,全球癌症病例预计癌症新增病例会从 2012 年的 1400 万,递增至 2025 年的1900 万,到 2035年将达 2400 万。Illumina公司预测基因测序全球总市场容量为200亿美元,肿瘤诊断与治疗应用方向为120亿美元,占比为60%,是基因测序最大的应用市场。同时,麦肯锡预测基因测序技术在肺癌、肠癌、乳腺癌和前列腺癌等领域的渗透率将高于20%。艾瑞分析认为,肿瘤诊断和治疗是基因测序最具发展潜力的应用市场,主要原因有:

1)全球癌症发病率逐步攀升,癌症负担正在不断加重,8 个死亡病例中就有 1 个就是癌症,特别对中国而言,人口老龄化的不断增加,环境污染和食品安全问题日益恶化,都使癌症的负担尤为突出;

2)由于肿瘤具有显著的个体差异性,传统医疗方式在肿瘤治疗上具有非常大的局限性,而基因测序能够提供病患个体差异信息,并为肿瘤治疗提供指导,能够提高用药的安全性和有效性。
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靶向用药相关基因检测、化疗用药相关基因检测、肿瘤易感性相关基因检测、肿瘤发生相关基因检测等等,全面的基因检测可涉及肿瘤诊疗的各个阶段:
1)预防--肿瘤基因检测;
2)诊治--个性化用药指导;
3)预后--复发监测和药效评估。

  • 肿瘤早期筛查:


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  • 肿瘤诊断:


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  • 肿瘤个体化用药及靶向治疗:

是针对已经明确的致癌位点,来设计相应的治疗药物,来设计相应的治疗药物,所以分子靶向治疗又被称为“生物导弹”。根据《 NCCN肿瘤学临床实践指南》 建议:肿瘤个体化用药基因检测是服用靶向药物时必检项目。

  • 靶向药物临床路径:

美国国立综合癌症网络(NCCN)《 结直肠癌临床实践指南》 中明确指出,(1)所有转移性结直肠癌患者都应检测KRAS基因状态;(2)只有KRAS野生型患者才建议接受EGFR抑制剂(如爱必妥和帕尼单抗)治疗。

美国国立综合癌症网络(NCCN)《 非小细胞肺癌临床实践指南》 中也指出:当KRAS基因发生突变时,不建议使用EGFRTKls靶向治疗药物。

美国食品药品监督管理委员会(FDA)规定,基因检测是靶向药物治疗的必要前提,只有相应基因突变的患者,才能成为靶向治疗的适用对象。 FDA已经强制要求用药前进行EGFR、 KRAS等基因检测。至2013年12月,FDA已经批准超过200个需要患者基因信息指导才能准确治疗的药物。广州市医保中心报销标准,只有EGFR基因突变检测为阳性的肺癌患者才可享受靶向药物的医保报销。

  • 药物代谢检测:

可以根据药物代谢基因的突变情况将药物代谢分为超快代谢、快代谢、中间代谢和慢代谢四种类型。检测药物代谢酶基因位点后,医生根据代谢类型确定用药剂量,从而提高疗效和减少不良反应。

  • 复发风险监测:

根据2011年《 NCCN乳腺癌临床实践指南》 ,部分侵袭性乳腺癌患者可以使用21基因预测化疗收益和10年内乳腺癌的复发风险。21基因检测通过研究21个基因( 16个癌症相关基因、 5个参考基因)的表达,计算复发风险值和评估化疗收益。

3、遗传性疾病:

遗传性疾病是由生殖细胞或受精卵的遗传物质,即染色体和基因,发生改变而引发的疾病,它有家族性、先天性等特点。血友病、白化病、色盲等都是遗传性疾病,肿瘤、高血压、冠心病、糖尿病和精神性疾病也往往同遗传有关系。遗传性疾病较难治愈,因此它对人类的危害较大。在25岁时,5.5%的人会患上遗传性疾病,随年龄增加,逐渐上升到60%;11.1%的儿童和12%的成年住院病人是由遗传因素导至的;30-50%的新生儿死亡是由于先天性畸形导至;2-3%的新生儿带有先天性或遗传决定的异常。

遗传性疾病又分单基因遗传病、多基因遗传病和染色体异常遗传病:

单基因遗传病是由单个基因发生突变所引起的遗传病。它可能是等位基因中的一个发生突变,也可能是成对的等位基因都改变。单基因病本质上属于单基因性状的遗传,故称之为孟德尔疾病。

多基因遗传病又称多因素遗传病(multifactorial inheritance)是由多个基因的累加效应引起的遗传性状,一般与环境因素共同作用。因有遗传因素在内,故发病呈家族倾向,但不符合孟德尔遗传规律,即同胞中的患病率远比1/2或1/4低,大约只有1%-10%。大多数先天性畸形如无脑儿、脊柱裂和其它神经管缺损以及大多数先天性心脏病,以及许多常见的成人疾病如癌症、高血压、冠心病、痛风、精神分裂症、抑郁症及糖尿病等,不是单纯由单基因突变或染色体异常所引起的疾病,这些疾病都是由多个基因和环境因素共同作用的结果,都属于多基因遗传病。多基因病与单基因病比较,在同胞(兄弟姐妹)中的发病率比较低,约为1%-10%(单基因病在同胞中的发病率一般为1/2-1/4),但在群体中的发病率却比较高。

如果人的染色体发生异常,也可以引起许多种遗传病,这些病在遗传学上叫做染色体异常遗传病。由于染色体变异常引起遗传物质较大的改变,患者大多寿命短暂,甚至在胚胎期就死亡造成流产。

NGS遗传性疾病应用原理:目标区域捕获测序和全基因组低覆盖度测序方法,加入相应的生物信息分析,来寻找与疾病相关的突变位点,为辅助临床诊断、辅助临床治疗和疾病筛查提供科学依据。

目标区域捕获:针对自闭症相关基因设计的特异性捕获芯片,对与疾病非常相关的170个基因进行捕获,对其中所有单个位点的遗传突变和小片段缺失重复的遗传变异进行分析。

全基因组低覆盖度测序:(low-coverage genome-wide sequencing)依托第二代测序平台,采用高灵敏度的高通量测序,对受检者的DNA进行全基因组低覆盖度测序,获得DNA分子信息,进一步通过生物信息学分析,准确定位受检样本的基因组上出现的染色体数目异常、染色体微缺失和微重复片段。该方法可检测1M以上的染色体微缺失、微重复,不适于检测点突变及1M以下的缺失或重复、平衡易位、单亲二倍体、嵌合体。

4、药物基因组学:

药物基因组学(pharmacogenomics)是研究基因序列的多态性与药物效应多样性之间关系,即基因本身及其突变体与药物效应相互关系的一门科学。

药物相关的基因大致可分为四类:
1)药物代谢相关的酶;
2)药物结合相关的受体;
3)药物转运相关的膜通道;
4)信号传导相关的蛋白质等的编码基因。

药物基因组学研究内容:药物基因组学研究药物效应的个体间差异,以基因多态性为基础,针对不同个体基因型进行个性化治疗。包括,药物效应的基因型预测和基因组学在医药上的应用;在分子水平上证明和阐述药物疗效、药物作用的靶位、作用模式和毒副作用。

药物基因组学研究目的:
1)合理用药, 个性化治疗;
2)新药的发现和开发

7
Illumina技术简介

二代基因测序技术(Next-generation Sequencing,NGS),又称为高通量测序技术(High-throughput Sequencing),可以一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定。相对于传统的Sanger测序,NGS有些显著的优点:1.测序效率大幅度提高;2.测序费用大幅度降低。

454公司在2005年推出焦磷酸测序平台后,很好的解决了传统Sanger测序的通量和成本问题,极大地推动分子生物学的发展,随后Illumina公司通过收购Solexa公司进军测序领域,并经过多年高速发展,已经成为全球测序仪的龙头企业。

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尽管NGS技术极大地推动生物技术的向前发展,都也并非完美无瑕。NGS的错误率依旧是其硬伤,因为NGS的读长(Read)普遍较短,短于Sanger测序,所以需要更严格和复杂的序列拼接,也带来错误率偏高的顽疾。

NGS技术分为两种:边连接边测序(Sequencing by Ligation,SBL)和边合成边测序(Sequencing by Synthesis,SBS)。在SBL方法中,带有荧光基团的探针与DNA片段杂交并且与临近的寡核糖核酸连接从而得以成像,人们通过荧光基团的发射波长来判断碱基或者其互补碱基的序列。SBS方法通常使用聚合酶,而且,诸如荧光基团在链的延伸过程中被插入其中。而我们要讨论的Illumina公司所采用的便是SBS技术。

SBS技术是指依赖于大量DNA聚合酶来进行测序的方法,但SBS技术其实还可进一步细分,可分为循环可逆终止(Cyclic Reversible Termination,CRT)和单核糖核酸增加(Single-nucleotide Addition,SNA)两种,Illumina公司即是CRT技术。

CRT技术有些类似于Sanger测序的末端终止法,其3’-OH被屏蔽而被阻止继续延伸。反应开始时,DNA模板被一段和探针序列互补的接头结合,DNA聚合酶也是从这段序列开始结合。每个循环过程中,四种单独标记的复合物和3’-OH被屏蔽的dNTP被添加进反应中。在延伸过程中,每结合一个dNTP,其它没被结合的dNTPs被移除,并且获取图像来确定是哪个碱基在哪个簇中被结合。荧光基团以及屏蔽基团随后被移除并且开始新一轮的反应。

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Illumina公司的两个测序平台Solexa和Hiseq的核心技术原理和主要操作步骤是相同的,现在对操作步骤进行介绍,共分为四步:

1)DNA待测文库构建

利用超声波把待测的DNA样本打断成小片段,打断成200—500bp长的序列片段,并在这些小片段的两端添加上不同的接头,构建单链DNA文库。

2)Flowcell

Flowcell是用于吸附流动DNA片段的槽道,当文库建好后,文库中的DNA在通过Flowcell的时候会随机附着在Flowcell表面的channel上。每个Flowcell有8个channel,每个channel的表面都附有很多接头,这些接头能和建库过程中加在DNA片段两端的接头相互配对,并能支持DNA在其表面进行桥式PCR的扩增。

3)桥式PCR扩增与变性

桥式PCR以Flowcell表面所固定的接头为模板,进行桥形扩增。经过不断的扩增和变性循环,最终每个DNA片段都将在各自的位置上集中成束,每一个束都含有单个DNA模板的很多份拷贝,进行这一过程的目的在于实现将碱基的信号强度放大,以达到测序所需的信号要求。

4)测序

测序方法前面已经有所提及,采用边合成边测序的方法,向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4种dNTP。这些dNTP的3’-OH被化学方法所保护,因而每次只能添加一个dNTP。在dNTP被添加到合成链上后,所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉。接着,再加入激发荧光所需的缓冲液,用激光激发荧光信号,并有光学设备完成荧光信号的记录,最后利用计算机分析将光学信号转化为测序碱基。这样荧光信号记录完成后,再加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP的3’-OH保护基团,以便能进行下一轮的测序反应。Illumina的这种测序技术每次只添加一个dNTP的特点能够很好的地解决同聚物长度的准确测量问题,它的主要测序错误来源是碱基的替换,目前它的测序错误率在1%—1.5%之间。

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附表:

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来源:医疗干货群
致谢:医疗干货群IVD企业发展史汇编组

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