 设想一次简单的抽血就能诊断癌症，是多么好的一件事情。这种想法也吸引了大量的商业新手。近年来，通过液体活检来诊断癌症吸引了大量的金钱和炒作，初创企业获投资基金是很常见的事情，研究者在著名期刊上“吹捧”液体活检也已经不足为奇。 今年年初，Illumina宣布创建新公司Grail，致力于开发一种不超过1000美金的血液检测，用于多类型癌症的早期筛查。总部位于旧金山的Grail，已经获得知名投资者（如亚马逊的Jeff Bezos 和微软的Bill Gates）超过1亿美元的投资资金。沿着海岸线的Pathway Genomics公司也已经布局了9种癌症驱动基因的血液循环肿瘤DNA（ctDNA）检测市场。Guardant Health公司已经宣布计划在年底公布其多组别多位点伞式试验的初步数据（分析ctDNA），他们利用成像以及其他技术来检测患者的血液，从而早期诊断癌症和分析个体的癌症危险因素。 然而，评论家认为，对于健康人而言，这种癌症筛查仍然是弊大于利，除非技术在灵敏度和可选择性上有所提高。罗氏医疗诊断的全球研究主管Walter Koch说，“癌症早期筛查还面临着很大的挑战......我担心没有充足的临床数据来证实它的发展空间如人们所想的那样大。” 尽管如此，液体活检仍然形成了一定的产业规模。根据Nature Biotechnology杂志统计的数据，目前国外在临床上使用的液体活检商业平台不少于15个。  图表来源：Nature Biotechnology官网 商机始于寻找癌细胞 癌症诊断的黄金标准——组织活检并不是没有缺点。它属于侵入性技术，给病人带来很多痛苦，而且对于一些癌症而言，组织活检相当困难，甚至是不可能的。此外它往往还伴有副作用或感染的风险。在许多情况下，肿瘤具有异质性，组织活检并不总能够提供足够的样本来分析完整的肿瘤突变范围以及潜在的病理，尤其是当恶性肿瘤已经发展成为转移性疾病时。更重要的是，组织活检反映的只是肿瘤在单一时间的特征。接受治疗后，原来的活检信息可能已经过时，不能准确地反映肿瘤遗传信息随时间的变化。 液体活检与之相反。通过血液检测，可以了解患者的肿瘤在不同时间中的状态。血液检测还能追踪肿瘤耐药性的发展，揭示残留病灶是否存在或者预示肿瘤是否复发。“如果临床医生最终能够将这些检测结果用到癌症的靶向治疗中，也许晚期癌症有望变成可控的慢性疾病，就如艾滋病一样”，Guardant Health公司的CEO Helmy Eltoukhy表示。 研究人员早在几十年前就已经知道，肿瘤脱落的细胞以及癌细胞凋亡脱落的DNA片段会流入到血液中；活的癌细胞也会脱落小囊泡，包含有DNA、RNA和蛋白质，也被称为外泌体。根据Murali Prahalad公司的CEO所述，“虽然这种脱落发生的概率很小，大概十亿个血细胞中只有一个，但循环肿瘤细胞（CTC）被认为是疾病转移的主要形式。随着时间推移，这些细胞建立了转移性位点。转移性位点流入循环系统中推动疾病的发展。” 最早进入液体活检商业市场的是Veridex公司的CellSearch循环肿瘤细胞检测方法。CellSearch检测方法2004年获美国FDA批准用于转移性乳腺癌，2007年获批准用于转移性结直肠癌，2008年获批准用于转移性前列腺癌。CellSearch检测方法相对狭窄，它只能检测到上皮细胞黏附因子阳性（EpCAM+）以及白细胞共同抗原阴性（CD45 -）的细胞。CellSearch检测方法采用一种可与铁微粒相结合的抗体（称为铁磁流体），这种抗体/铁磁流体同CTC有极强的特异性结合能力，结合后再应用强力磁体将这些CTC从血液样本中提取出并进行生物或化学染色。CellSearch系统就是通过这种方法来选择EpCAM+和CD45 -细胞。 然而，使用一个抗体来对付单一的标志物如EpCAM，这并不理想。非上皮性肿瘤或者其他脱落EpCAM的肿瘤往往能逃脱这种检测方法。哈佛医学院的Mehmet Toner 开发了一种替代方案。 Toner 相信在草堆中寻找一根针，最好的办法是拆除草垛。他的研究团队与马萨诸塞州综合医院的Daniel Haber合作，致力于开发微流控技术，研究项目由Johnson & Johnson支持。 其他公司也正在利用癌细胞的不寻常特征来将其与典型的血细胞分离。美国加州的Vortex Biosciences公司拥有一个具有专门通道结构的微流控设备。该设备可以捕获较大的肿瘤细胞，同时允许较小的血细胞通过。他们计划将在2017年第一季度将该设备带入市场。休斯敦的ApoCell公司利用细胞的介电性能将癌细胞从其他血细胞中分离出来。 Epic Sciences公司同样也对CTCs广撒网。他们结合细胞形态学、蛋白质生物标志物分析和专有算法开发了成像平台，用来追寻CTCs的踪影，另外他们还与生物制药伙伴合作设计药物研发实验。Epic Sciences公司已经开发出了前列腺癌临床检测方法——Epic AR-V7，该方法将通过Genomic Health of Redwood City协议在美国实现商业化。 ctDNA测序拓展了技术和市场的发展空间  分离CTCs给市场带来了很多的商业机会，因为同种样本可以有很多种检测方法。但从筛选角度来看，超越细胞可能会给临床液体活检带来更简单且更可靠途径。随着肿瘤细胞死亡，它们的DNA片段会被释放到血液中。这些序列中的突变可以帮助研究人员拼凑出肿瘤细胞的遗传图谱，且ctDNA的材料来源会更加丰富。 MD安德森癌症研究中心临床研究员John Heymach曾致力于CTCs和ctDNA的研究，但他认为从临床常规使用角度来看ctDNA更有优势：原材料无需新鲜且更适合高通量的方法，检测时耗时耗力更少。 2014年开始进入市场的 Guardant360 检测方法，主要针对四种突变类型：单核苷酸变异、拷贝数变异、融合和插入/缺失，这只是利用二代测序或PCR技术来检测ctDNA基因突变的其中一个例子。Illuminaqixia的Grail采取了同样的策略——基于ctDNA的癌症早期检测多基因panel。纪念斯隆-凯特林癌症中心的José Baselga说，“无论是从广度还是深度，这将是一场激烈的测序。” 今年5月份， Foundation Medicine推出了液体活检平台——FoundationAct，该平台利用二代测序技术来检测62个相关基因所有类型的变异。今年4月份美国癌症研究协会年会上公布了多种癌症的400多份样本的分析数据，揭示了98%的敏感性，也就是说如果患者的一个突变在检测极限之外，那么它被检测的概率为98%。 Stephens指出，即使是黄金标准，福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的组织活检也存在局限性。他们发现三分之一的表皮生长因子受体基因突变和三分之一的间变性淋巴瘤可能无法被当前的方法检测到，这也体现出了FFPE诊断难以在一些癌症中执行，这又增加了对ctDNA技术的需求。不过不同肿瘤患者的ctDNA可检测性不同，正如下图所示。  图表来源：Nature Biotechnology官网 商业价值一：检测肿瘤或颠覆黄金标准 到目前为止，大多数液体活检的研究都集中在晚期、转移性疾病的患者。与早期癌症患者相比，这类患者往往有更多的肿瘤，它们释放到血液中的细胞和核苷酸更容易被检测到。 灵敏度是一个很关键的问题。相比之下，检测的特异性目前已经非常高了。“如果液体活检检测到一个突变，那么突变存在的可能性会很大”，Heymach 说。但在这里需要给大家一个警告：组织活检和液体活检不一定呈现的是同一个肿瘤的特征。组织活检、ctDNA以及CTC中的DNA分析结果表明，不同活检类型的突变检出率相似，但不一定检测到同种突变，虽然有重叠，但重叠率不会达到100%。 结果的不一致性可能源于肿瘤组织活检与液体活检的时间差异。今年6月份，Guardant 在美国临床肿瘤学会年会上公布了超过15000名患者的液体活检试验结果。在400份样本中，组织活检和液体活检（ctDNA）结果的匹配度为87%，灵敏度达90%以上。但液体活检的阴性结果并不排除癌症的可能性。液体活检或许并不是某类癌症的最佳选择。在Guardant的研究中，晚期癌症组中超过15%的患者血液中检测不到ctDNA，包括胶质母细胞瘤患者。可能是脑血屏障阻止了ctDNA进入外周血，从而降低了检测的灵敏度。 “该领域仍需要整理”， Personal Genome Diagnostics联合创始人、约翰霍普金斯大学的Victor Velculescu说，“从这个领域我们了解到，任何分析都不是完美的。”尽管肿瘤组织活检始终很重要，但他认为液体活检会是一个特别的方式来追踪肿瘤随时间的变化，而且还属于无创性技术。 然而，并不是每个人都相信肿瘤组织活检和液体活检结果的差异会给新技术的发展带来障碍。肿瘤组织活检存在的误差、偏差和时间滞后性，作为检测的黄金标准，Baselga质疑它的结果是否真的能代表肿瘤的真实病理。相反，他更希望研究ctDNA水平和治疗反应之间的关系，而不是比较ctDNA和肿瘤组织活检。 商业价值二：给临床治疗带来有用信息  根据Heymach，检测生物标志物只是液体活检的一部分，更难的问题在于该如何处理这些信息。许多遗传标记可以预测复发，但不一定能改变治疗。Janssen Diagnostics的首席医疗官Jorge Villacian说，“结果依赖于很多东西，而最重要的是新疗法的可用性。” 去年12月份，在 San Diego乳腺癌研讨会上， Baselga及其团队表明在不久的将来液体活检将开始引导疗法。他们开展的BELLE-2试验研究了PI3K途径对雌激素受体阳性的晚期乳腺癌患者的影响，利用液体活检来寻找血液中PI3K突变的催化亚基（PIK3CA）。在587名患者中，他们检测到了200名存在该突变，并给这200名患者施以 buparlisib+ Faslodex（雌激素抗体药物）联合疗法。与单独使用 Faslodex疗法相比，采用联合疗法的患者无进展生存期（PFS）从3.2月增加到了7月。Baselga指出，“ctDNA突变的存在是最好的预测。”然而，肿瘤组织活检出现PI3K突变的患者使用联合疗法后，并未得到相同的改善。这也体现出了生物复杂性还面临着很大的挑战。 涉及193名患者的一项前瞻性研究使用 Epic Science公司的CTC技术来检测雄激素受体剪接变异体7（AR-V7）。AR-V7也被认为是转移性前列腺肿瘤抵抗雄激素受体信号抑制剂的生物标志物。数据显示，AR-V7有较差的疾病预后，但对紫杉醇化疗的反应优于雄激素受体信号抑制剂，例如 Zytiga和Xtandi7。 Pathway Genomic公司的首席医疗官Glenn Braunstein说，“病人的结果是个很关键的问题，如果我们或者其他公司提供的ctDNA检测真的有用，那么我们将看到所有患者治疗结果的改善。” 目前，一些试验正在观察ctDNA检测的长期结果。在市场上使用二代测序来检测ctDNA和CTCs的Cynvenio 公司（美国加州）已经启动了一项试点检测研究，专门针对正在接受治疗的三阴性乳腺癌患者。他们通过检测ctDNA、CTCs和自然杀伤细胞来监测疾病是否会复发。另外，Pathway Genomics 公司目前正在招募临床试验志愿者，他们设计了为期5年的追踪试验。这些研究者们都希望后期的长期大型试验得到更多的支持。 商业价值三：癌症早期检测是终极奖杯 对于晚期恶性肿瘤患者，液体活检仍然还存在很多障碍，但与癌症早期检测面临的挑战相比，这些障碍会变得很苍白，癌症早期检测也将是液体活检的终极奖。 癌症早期检测可能会带来不必要的压力，会导至一些潜在疾病的干预措施，但是这些潜在疾病可能不会出现。早期诊断也许只能意味着病人被诊断得更早，但并不代表能活得更长，这种现象也被称为“领先时间偏倚（lead-time bias）”。Velculescu说，“对于早期检测，我们并没有充分了解这些方法的用处以及强大之处。例如，如果临床医生在液体活检中发现了一些东西，他们不一定知道下一步该做什么，因为检测并没有告诉他们潜在的肿瘤在哪里。” Pathway Genomics公司的Braunstein 承认，这种类型的早期检测可以给病人一些虚假的安全感。他们的检测方法对I期癌症的ctDNA突变检测率为17%，对4期患者的突变检测率为50%。“在临床试验中，我们试图强调一个低水平的阳性并不意味着就患癌症。”一个低水平的阳性检测可能需要在三个月内进行第二次检测，或者进行成像检测等。他预计，ctDNA可能会经历其他检测技术如PSA所面临的挑战。 液体活检存在的一些局限性可能取决于肿瘤生物标志物。 Guardant公司的 Eltoukhy说，“不同癌症会有不同的临床敏感性。例如晚期脑癌的敏感性比其他类型的肿瘤要低。从生物标志物的角度，我们很快就会看到疾病早期阶段的分叉。” 加州圣地亚哥穆尔斯癌症中心的Razelle Kurzrock说，“如果游离DNA出现异常，我们并不知道这意味着什么。我们知道良性病变看起来很像驱动突变。”尽管有批评的态度， Kurzrock仍呼吁技术的变革，并与2016年在圣地亚哥创办了CureMatch公司，致力于推进液体活检技术在精准医学中的应用。 早期检测率并不会达到100%。在I期或II期癌症，它可能只达到30%到40%。Personal Genome Diagnostics公司的联合创始人、约翰霍普金斯大学医学院 的Luis Diaz估计，即使一个检测只能捕获到一半患者的疾病症状，它每年也能诊断20%的癌症。 即使存在这些挑战，大多数研究人员仍认为液体活检在癌症早期筛查领域具有潜在的价值。Velculescu 说，“我相信这是几年的问题，而不是几十年的问题......我们将开始看到人们使用这种方法来识别高风险人群。” 商业化的大挑战：监管和保险 即使病人的试验结果数据仍然很模糊，一些公司还是将液体活检推向商业化，纷纷在研究或者临床试验中布局市场，或者把目标定向诊所。在国外，大多数公司选择了LDTs模式（Laboratory Developed Tests，LDTs），而LDTs是由临床实验室改进修正案（CLIA）管理。CLIA的规则是确保检测方法在实验室中的准确性和可靠性，并未对检测结果的临床有效性进行保障。 不过FDA也开始有了一些动作，表示将扩大对LDTs的监督，尤其是针对一些复杂的、有望用于指导治疗决策的检测方法。例如，FDA对LDTs出台了建议指南，将用于癌症早期诊断的ctDNA检测归为高风险方法，因为检测结果可能导至后续的一系列检测，并且可能与治疗决策有关。 去年9月份，Pathway Genomics公司 的 CancerIntercept检测方法受到了FDA的警告。FDA强调了直接面向消费者的营销以及他们的早期癌症检测方法缺乏临床数据支撑。自那以后，Pathway Genomics 公司改变了策略，如今CancerIntercept检测方法以高风险癌症筛查工具的形式提供给临床医生，主要针对具有家族史或吸烟的高危人群。 Guardant360检测方法以LDTs的形式在市场上竞争了两年，然而它的供应商正积极参与FDA的监管，Eltoukhy 说，“我们应该在不扼杀创新和进步的情况下让技术真正落实。但如果监管门槛很低，会收到很多临床医生和纳税人的投诉。坦率的说，这还只是噪音的一小部分。”今年6月份，罗氏基于PCR的 EGFR突变检测V2获得了FDA的批准，它也是首个获批准的可用于辅助临床决策的液体活检试验。 监管并不是这个领域面临的唯一挑战。液体活检成功商业化后，使用者不得不为其付费。公司面临的大挑战是如何为昂贵的诊断测试铺一条保险报销的途径，他们需要临床证据来确保新技术的保险报销，因而更高的监管门槛可能对行业的发展更好。 癌症药物疗程通常为六位数。当考虑使用联合疗法时，液体活检可以为临床医生提供工具来选择治疗方案和检测治疗结果。但目前报销是诊断公司面临的大问题。Prahalad说，“很奇怪，为何对昂贵药物的报销质疑远远不如对药物反应检测方法的质疑。” 价格需要往下降，特别是随着时间推移而开展的多重检测。筛查试验必须符合成本效应。许多家庭在癌症周期中会面临财务问题。如果一组测试一年只花几百美元，对于大多数人来说，它是一个可管理的费用，这样才能让更多人负担得起。 参考文献： |
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