液体活检在妇科肿瘤早期筛查中的意义

妇科恶性肿瘤的早期精准诊断，一直是困扰人类健康的一大问题。基于高效、经济的早期诊断基础上的早期治疗，是患者获得良好预后的基本保障。然而迄今为止，如何进行妇科肿瘤的早期筛查一直是困扰基础与临床研究工作的热点。近年来，由于二代测序技术的飞速发展，目前“液体活检”技术初现端倪，在各种类型的肿瘤中均有研究，其具有无创、精准的特性，既可作为筛查手段，又可指导精准治疗，还可以提示疾病预后，从为数不多的研究中崭露头角，拥有其他检测技术不可比拟的独到优势。本文综述了液体活检在妇科肿瘤的早期筛查中的作用和意义。

1  关于“液体活检”

“液体活检”（Liquidbiopsy）是一种新兴的无创检测技术，MIT TechnologyReview杂志将其列为2015年度十大突破技术之一。该项技术是通过采集患者体液（包括血液、唾液、汗液及分泌物等）对体内的肿瘤或移植器官状态进行监测的方法。目前常见的检测项目包括循环肿瘤细胞（Circulatingtumor cell, CTCs）、循环肿瘤DNA（Circulating tumor DNA, ctDNA）及肿瘤细胞来源的外泌体（tumorcell-drived exosomes, TEXs）等。目前在临床上已开展的产前无创基因检测即为液体活检的标志性应用之一。

2  ctDNA的特性与检测方法

2.1  ctDNA的特性  ctDNA是肿瘤细胞脱落于循环血液中的DNA片段。正常状况下，人的体液内即存在有游离的双链DNA片段（cell free DNA），称为cfDNA，这些片段长度小于正常的DNA，但是携带有正常的基因组信息[1]。健康人体内的cfDNA含量很低，主要来源于坏死细胞和凋亡细胞。而研究者发现恶性肿瘤患者体内的cfDNA量显著高于非肿瘤患者[3]。ctDNA来源于肿瘤细胞，是cfDNA的一部分，仅见于肿瘤患者体内。ctDNA携带有肿瘤细胞的基因组片段，这意味着含有肿瘤特异性的突变，通过检测ctDNA水平及特征性的突变可以实现对肿瘤的诊断及检测。一般认为ctDNA在早期症状出现之前就已经出现在循环中，因此早期对ctDNA检测可以实现肿瘤的筛查。

最新的一项研究通过对cfDNA进行深度测序，绘制了人类的核小体基因组图谱，结果表明cfDNA中的核小体带有其来源细胞的基因印记，通过分析这种印记可以明确其组织学来源。这项技术若应用于肿瘤筛查中，那么在初诊时不仅可以明确肿瘤性质，还可以获得组织学类型、解剖位置等信息，直接指导后续相关的治疗[3]。

2.2 ctDNA的检测方法近年来，不同的研究表明ctDNA在某些类型的肿瘤中可以作为特异性的分子标记物，如肺癌、胰腺癌、结肠癌等。由于不同类型肿瘤ctDNA显现出不同的生物学特性，需要用不同的手段检测。Natrue上发表的一篇文章总结了目前ctDNA的检测方法，包括①cfDNA定量检测；②肿瘤特异性杂合性丢失（loss of heterogeneous, LOH）；③肿瘤特异性基因突变检测；④DNA完整性改变检测；⑤表观遗传学改变检测，如甲基化；⑥循环核小体检测；⑦病毒DNA检测等[4]。其中cfDNA定量、表观遗传学改变及病毒DNA检测常用于妇科恶性肿瘤的诊断与筛查的相关研究。

3  ctDNA与妇科恶性肿瘤

3.1  ctDNA与卵巢癌  

卵巢癌起病隐匿，早期通常无症状，绝大多数患者因症状就诊时往往已届晚期。目前常用的筛查方法包括CA125、HE4、经阴道超声等联合应用，尽管如此卵巢癌的筛查方法一直没有实质性突破，因此医成为目前研究的热点与焦点。

Kamat等[5]通过实时荧光定量PCR的方法发现卵巢癌患者血浆中cfDNA水平与良性肿瘤患者或健康对照相比显著升高，而且在早期即有明显差别。若以cfDNA＞ 4,500GE/ml为筛查界值，敏感性可以达到87%，与CA125相似。此外，若cfDNA＞22,000GE/ml常常预示着晚期或高级别肿瘤，预后相对较差。由此可见ctDNA的定量检测不仅可以用于卵巢癌筛查，对指导预后也有一定意义。

许多研究曾报道卵巢癌细胞的某些基因存在异常的甲基化现象，包括BRCA1、MLH1、HOXA9、RASSF1A、SPARC、HIC1、DAPK、OPCML、CCBE1等基因[6]。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的催化下，以S-腺苷-L-甲硫氨酸为甲基供体，将胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶的过程。这种过程虽然不能改变DNA序列，但是却能调控基因的表达，属于表观遗传学的范畴。当抑癌基因启动子区发生异常甲基化时，能够影响启动子与转录因子的结合，使抑癌基因失活，这一过程与卵巢癌的形成与发展密切相关。有研究者对50例卵巢癌患者的肿瘤样本及术前的血清或血浆、腹水或腹腔冲洗液通过甲基化特异性PCR（MSP）的方法进行特定基因的检测，在68%的样本中发现了BRCA1或RASSF1A中至少一个的甲基化异常。对其余样本继续检测APC、p16、p18和DAPK基因，均发现了至少一个基因存在超甲基化。由此研究者认为，若对这六种基因进行联合筛查，敏感性即可达到100%[7]。ZhangQ等[8]采集202例卵巢癌患者的术前血清样本，通过multiplex-MSP的方法，对APC,、RASSF1A,、CDH1、RUNX3、 TFPI2、 SFRP5 和OPCML基因进行联合检测，得到的敏感性和特异性分别为85.3%和90.5%，显著优于单用CA125进行筛查。此外，LiggettTE等[9]人使用微阵列法对90例卵巢癌样本的血浆进行检测，结果表明RASSF1A、CALCA和EP300基因的启动子异常甲基化可以联合用于卵巢癌筛查，其敏感性和特异性为90.0%和86.7%。

    DNA的异常甲基化在卵巢癌早期无症状时即可发生，通过液体活检的手段，可以无创地检测出ctDNA的异常甲基化。并且通过对几个不同基因的联合筛查，能够提高检测效力。

3.2  ctDNA与宫颈癌

目前认为，宫颈癌一种与高危型人乳头瘤病毒（humanpapillomavirus，HPV）感染相关的疾病，其中最常见的类型为HPV-16、18型。除了宫颈分泌物之外，宫颈癌患者的血清中也含有HPV DNA，相关研究认为存在于血清中的HPV DNA来源于肿瘤细胞，因为血清中HPVDNA类型与肿瘤组织相同。因此可以通过定量检测血清HPVDNA替代ctDNA的定量检测。

宫颈癌患者血清中HPV DNA的阳性率较低，在一项纳入58例宫颈癌患者的研究中，肿瘤组织HPVDNA阳性率为94.8%，而血清HPV DNA阳性率仅为11.8%，且CIN患者均为阴性[10]。另一项来自印度的研究纳入了100名巴氏涂片结果异常的患者，用实时荧光定量PCR的方法检测16、18、33、52型HPV DNA，以E6为引物进行扩增，结果阳性率为19%，均为HPV-16型或HPV-18型；定量检测结果表明血清HPVDNA的载量在晚期患者中显著上升[11]。由此可见，血清HPV DNA与宫颈癌的进展存在一定相关性，定量检测HPVDNA不仅可以辅助诊断，还能够判断疾病进展。随着研究的完善，血清HPVDNA或许有望成为宫颈癌的分子标志物之一。

仅有HPV感染并不能导至宫颈癌，肿瘤的发生必然伴随着遗传物质的改变。许多研究表明宫颈癌细胞基因组中同样存在异常的甲基化，包括抑癌基因启动子过甲基化导至抑癌基因失活等。通过液体活检的方法可以检测血中异常甲基化的基因，从而达到早期诊断的目的，但是筛查哪些基因目前没有定论。有研究者纳入109例低级别与高级别宫颈病变的组织学标本进行检测，发现SOX1,PAX1, LMX1A, NKX6-1, WT1 和ONECUT1六种基因，其甲基化程度与对照组有明显差异[12]。这一结果可以应用于液体活检中，通过测定患者血清中是否含有这六种基因的甲基化异常，但需要进一步研究证实其敏感性及特异性。

一项同时检测宫颈癌患者肿瘤组织和术前血浆样本中 DAPKp16和MGMT基因启动子甲基化现象，结果表明 这三种基因甲基化在组织学上的阳性率分别为60%, 28.2%, 和18.8%，而在血浆中阳性率仅为40%, 10%, 和 7.5%[13]。另一项相关研究则选取了血清CALCA、 hTERT、MYOD1、PGR和TIMP3进行联合筛查，结果表明93份宫颈癌患者血清样本中，有81份（87%）中存在有异常的甲基化，其中MYOD1甲基化常见于晚期宫颈癌中，而血清MYOD1甲基化阴性的患者较MYOD1甲基化阳性患者无进展生存期和总生存期均延长[14]。由此可见通过检测血浆或血清中抑癌基因启动子甲基化，不仅可用以宫颈癌的诊断、筛查，而且对判断预后有一定帮助，但是如何确定候选基因尚有待进一步的研究证实。

3.3  ctDNA与子宫内膜癌

近年来，子宫内膜癌的发病率逐年上升。大多数子宫内膜癌患者早期即出现症状，如阴道不规则流血或排液。超声影像学检查在筛查与发现子宫内膜癌具有独到的优势，具体表现为无创、经济、敏感性与特异性高。若超声筛查阳性，可以通过刮宫术或宫腔镜监视下活检，协同提高子宫内膜癌的早期诊断。

有研究通过对子宫内膜癌患者及良性病变患者行cfDNA定量检测，结果表明子宫内膜癌患者cfDNA定量略高于良性病变患者，但是无统计学意义（P=0.095）；患者术前和术后相比，cfDNA水平差别也不具有统计学意义[15]。该研究表明ctDNA定量在子宫内膜癌筛查中的应用存在一定局限性，基于目前的研究水平，须考虑运用其他传统的检查方法。

子宫内膜癌患者血清中同样存在有异常甲基化的DNA片段，但是相关研究甚少。一方面由于子宫内膜癌早期症状明确，常规人群不需要进行筛查；另一方面通过宫腔灌洗液或子宫内膜活检的方法可以简单、方便的获得细胞学标本，对组织学标本的DNA检测较血清或血浆中更为精确。所以目前认为循环肿瘤DNA的检测并不适用于子宫内膜癌的早期筛查。值得一提的是，特殊类型的子宫内膜癌，如浆液性癌，其侵袭转移能力强，早期即可发生盆腔转移。若能通过ctDNA对这些特殊类型的子宫内膜癌进行筛查，临床意义更大[16]。

3  未来与展望

循环肿瘤DNA检测通过采集患者外周血，即可获得体内肿瘤细胞的基因组信息，是一种突破性的革新技术。与传统的穿刺活检等方法比较，液体活检具有以下独到的优势：①无创，避免了传统方法为患者带来的不适；②取样全面，一次性采集体内肿瘤细胞的全部信息，避免肿瘤异质性带来的取样不全；③精准，直接获得肿瘤基因组信息，同时用于指导后续靶向治疗；④早期即可在血中检出，甚至早于影像学发现，可以用于癌症的早期筛查；⑤通过对多种基因联合筛查可以提高敏感度及特异度。

    但是，循环肿瘤DNA检测作为一种新兴技术，仍存在着许多问题。首先这项技术目前只停留在试验阶段，缺乏统一的标准。如对于血样采集、DNA分离、检测手段等，不同试验研究中异质性非常大，相互缺乏可比性。其次，肿瘤的异质性决定了其基因突变位点多而复杂，如何确定最优的候选基因需要研究者们的进一步研究。最后，目前对于循环肿瘤DNA的检测技术的精确度仍不完善，组织学与血液学结果存在显著差异。因此，有研究者对ctDNA的应用前景提出了疑问，即肿瘤进展的不同阶段会产生不同的突变，凡此均增加了ctDNA检测的复杂性；另外，作为一种尚臻完善的技术与方法，如若贸然普及应用于健康人群的筛查，那么筛查阳性人群的后续当如何处理，或许存在伦理学的冲突，若立即积极处理，是否存在过度治疗，影响患者的生活质量，特别是在经验不成熟时，医生应怎样稳妥的处理和对待这些，都是未来需要进一步解答的问题[17]。