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特异性抗体检测在2019-nCoV诊断中的价值与影响因素

2020-6-26 00:33| 编辑: 小桔灯网| 查看: 3047| 评论: 0|来源: 临床实验室

摘要: 作者:迈克生物免疫技术首席科学家 田君喜庚子年伊始,突然爆发的新型冠状病毒肺炎疫情席卷全球。全国医务人员闻令而动,奔赴抗击疫情一线,经过全国人民齐心努力,中国疫情得到有效控制。中国科学家在此次疫情中展 ...



作者:迈克生物免疫技术首席科学家 田君喜




庚子年伊始,突然爆发的新型冠状病毒肺炎疫情席卷全球。全国医务人员闻令而动,奔赴抗击疫情一线,经过全国人民齐心努力,中国疫情得到有效控制。中国科学家在此次疫情中展现了较强的实力和责任担当,在疫情初期第一时间就确定了病原体为新型冠状病毒,并及时向全世界公布了病毒全基因组序列,这为后来全世界疫情防控发挥了重要作用。

在传染性疾病的诊断中,一般需要三个方面的证据,即临床特征、流行病学和病原学诊断。临床特征主要是患者症状和临床体征;例如新冠肺炎的胸部CT影像呈现双肺磨玻璃样病变典型改变,但这尚达不到传染性疾病诊断的金标准,因此不足以做出诊断。而流行病学主要是追溯疑似患者的传染来源及其传播途径。只有病原学诊断,也就是从患者标本中找到病原体病毒本身存在的证据,才是确诊的金标准。经典的病原学包括病原体的分离和体外培养,通过显微镜(细菌等)或电子显微镜(病毒)研究其形态特征,接种实验动物甚至志愿者观察是否出现类似症状等。现代病原学侧重阐明病原体的遗传信息(核酸序列),当知晓了即使是一部分的病毒遗传信息,就可通过PCR(DNA病毒)或RT-PCR(RNA病毒)对含病原体的标本实现有效检测明确诊断。


在疫情发生后,相关企业迅速开发了RT-qPCR核酸检测试剂,该技术对患者确诊和传染源确定具有重要价值。核酸检测是一种数字化技术,因此其精准程度很高;但核酸检测受场所、设备的限制较多,操作复杂,耗时,较难实现快速大量地检测标本。此外,核酸检测“检出率低”的问题是武汉疫情最严重时期的主要困扰之一,除非有实验室污染、引物设计不合理等原因,一般不会出现假阳性发生误诊。但病毒在什么时间或什么部位出现是非常不确定的,有时是瞬时的(例如病毒血症);新冠病毒使用鼻或咽拭子的检出率报道为40%~80%不等,有时需要反复检测不同的标本才能提高检出率,例如痰、肺泡灌洗液、粪便等。而抗体是人体免疫系统的重要组分,主要存在于血液,少量存在于粘膜组织。当人体受到外来物(细菌、病毒等)或体内新生物(例如肿瘤细胞)的侵入时会激发免疫应答反应,产生细胞免疫和体液免疫,最终抑制或清除侵入物。抗体与侵入物(抗原)之间的关系是一种特异性的相互识别,当血液中发现了新冠病毒的特异性抗体就意味着发生过病毒侵入,因此,特异性抗体检测能够提高病毒感染性疾病诊断的准确性。


抗体检测通常被称为血清学诊断,也属于一种病原学证据;抗体与病毒的蛋白分子上的某个结构域(表位)具有较高的亲和力,它与其它分子的亲和力很低,因此,它可以特异性地识别和结合病毒;但它不具有核酸检测那种数字化的精确性,所以,其病原学证据等级要低于核酸;抗体的主要优点是它在血液中的存在很固定,研究显示,在新冠肺炎患者发病15天后的检出率可高达100%,因此可做为核酸检测的有力补充。以下将进一步讨论抗体检测的应用前景及其主要局限性。






抗体检测假阳性的影响因素


抗体检测与其他免疫检测一样,新冠病毒抗体检测也会出现一定概率的假阳性,不同厂家试剂报道的假阳性率为从<1%至10%不等。假阳性率的可接受范围应以疾病的自然感染率为参照;武汉市目前的感染率约为0.3%~0.4%,湖北省(除武汉)约为0.03%~0.04%,四川省约为0.0006%。可见抗体检测的假阳性率要远高于自然感染率。因此,国家药监局对抗体试剂的适用人群严格定义为“核酸检测为阴性的疑似患者,或与核酸检测共同用于疑似患者”,就能够有效降低抗体检测假阳性给疫情防控带来的消极影响。抗体检测假阳性的原因主要有以下四个方面:


1. 干扰物质:各种干扰物质如RF因子、HAMA抗体、嗜异性抗体、血浆纤维蛋白、补体等等;不同原材料、不同原理、不同厂家的试剂所受的干扰很不相同,因此怀疑假阳性时可以相互交叉验证或排除。


2. 试剂因素:非特异性吸附来源于试剂组分的亲/疏水特性、电荷吸附、空间结构陷阱等原因。


3. Cutoff值设定:阳性判断值(Cutoff)通常是检测一定数量的确诊患者和非感染者,然后计算 {(灵敏度+特异度)-1 } 最大值进行设置的;这样设置的Cutoff值经常与最优的阴性预测值(NPV)和阳性预测值(PPV)不一致;NPV和PPV与疾病的自然感染率密切相关。因此,可以针对不同感染率地区、不同的使用目的(诊断或防控)、不同的使用策略(与核酸配合、不同抗体试剂相互配合)制定不同的Cutoff值以获得最优的效益成本比。


4. 用Megalign软件(DNAstar)分析的新冠病毒与SARS及另外4种普通冠状病毒基因序列的比较(图1、图2、图3)。可见新冠病毒与SARS的相同性较高,而与其他冠状病毒的相同性较低。SARS的自然感染率很低,一般不会带来较多的交叉反应。N蛋白与其他冠状病毒的基因序列的相同性要明显高于RBD和S1,当试剂是以N为主时,需要关注普通冠状病毒对检测结果可能有影响。







抗体检测假阴性的影响因素


核酸检测在理论上应该早于抗体检测,抗体一般在发病3~5天后开始陆续检出,15天以后才能保证稳定检出。抗体检测假阴性的原因分析如下:


1. 新冠病毒抗体检测的“窗口期”,现在还没有足够的数据资料。早期患者在窗口期时,其抗体还处于检测限以下。


2. 患者被施以免疫抑制剂治疗,可能会滞后抗体的产生或提前抗体的下降,抗体长时间处于检测限以下。


3. 试剂所用抗原有缺陷,可能造成漏检。


4. 临床上发现有些患者曾出现过1次核酸阳性,但临床症状轻微或无,抗体检测多次为阴的病例;这种情况可能是核酸检测出现了假阳,或鼻咽中的病毒最终未能侵入血液。






抗体检测能否做为确诊的证据?


当患者的临床特征和流行病学证据充分,即使核酸结果为阴性,一个准确可靠的抗体阳性结果肯定可以做为确诊的证据。抗体检测的主要局限性在于早期患者的阴性结果不能做为排除的依据,同时对阳性结果必须谨慎地甄别假阳性的可能。张瑞教授、李金明教授建议需要两次以上的动态监测,可有效识别假阳,也可避免“窗口期”假阴;该文具有很好的指导性意义,摘录其“动态检测及判断方法”的图解如下(图4)。



抗体检测中出现的假阳性绝大多数都与某种特定的方法相关联,一种方法的假阳性在原料原理不同的另一种方法上很少也出现假阳;因此,选用不同试剂进行补充实验就可以识别和排除绝大多数的假阳。例如IgG使用间接法、IgM使用捕获法,两者的反应原理有所不同,同时出现假阳的概率很小,因此,双阳(IgM+IgG+)的可信度是较高的;但有些厂家的IgM和IgG试剂都使用间接法,使用相同的抗原及反应体系,只有二抗不同,这两个指标就容易同时出现假阳,误导性较强。捕获法IgM与双抗原夹心法总抗体在原料和原理上的差异很大,属于最好的技术搭配。对于IgG或IgM单阳的结果都有必要进行补充实验或动态监测,排除假阳性后再下阳性结论。国内新冠抗体检测获证品牌技术参数(图5)。







抗体检测对2019-nCoV的流行病学调查的意义


疫情发展到今日已超出了单纯的医药健康领域。病毒“从何处来、将去往何方”的巨大疑问将长期萦绕在人们心中。新冠病毒的自然感染率、隐性感染率、无症状携带者、病毒的“源头”等,这些重大课题都需要流行病学研究予以解答。流行病学调查一般都需要检测或筛查大量的标本,高通量自动化的抗体检测更能发挥其优势。病毒在绝大多数患者身上只是一个“暂时的过客”,经常几天/十几天后就消失或测不到了,而抗体具有长久的“记忆力”,因此,核酸检测对流行病学调查的意义相对较小。例如筛查一定数量的普通人群,排除假阳后的阳性者分为治愈患者和隐性感染者,隐性感染者再查核酸和/或胸部CT,如果核酸阳性就可能是无/轻症状携带者;用抗体检测在时间轴上向后追溯留存的血清标本,是寻找感染“源头”的常用方法之一。


迈克生物股份有限公司 供稿


注:本文来源于《临床实验室》2020年第6期“代谢性疾病”专题

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