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解读指南丨病原微生物宏基因组检测阴性报告

2019-9-12| 编辑: 面气灵| 查看: 255| 评论: 0|来源: 杰毅生物

摘要: 宏基因组测序技术(mNGS)在病原学诊断中,与临床传统的方法(微生物培养、抗原/抗体免疫等)相比,显著的优势是病原体覆盖的范围广,敏感性、特异性高。以血流感染为例,根据近年来的文献报道和临床样本的实际检测 ...


宏基因组测序技术(mNGS)在病原学诊断中,与临床传统的方法(微生物培养、抗原/抗体免疫等)相比,显著的优势是病原体覆盖的范围广,敏感性、特异性高。以血流感染为例,根据近年来的文献报道和临床样本的实际检测数据统计,mNGS检测外周血的敏感性超过50%,显著优于血培养(敏感性20%左右)。但即便是高达50%的血流感染检出率,也意味着有近一半的临床病例会收到阴性报告。接下来就和各位探讨下mNGS检测为阴性结果的可能原因。


原因分析


No.1

患者症状由非感染性因素引起


以临床常见的不明原因发热(FUO)为例,引起经典型发热待查的因素可以大致分为四类,分别是感染性疾病、非感染性炎症、肿瘤和其他疾病。举例说明:


a) 非感染性炎症。感染和炎症是两个不同的概念,感染是引起炎症最常见的原因,但炎症不一定都是由病原微生物感染引起的。例如结节病是一种非干酪样坏死性上皮细胞肉芽肿炎症性疾病,可有发热、不适、厌食、体重减轻、干咳、哮鸣、呼吸困难、斑点或丘疹样皮疹以及关节痛等症状。此外,自身免疫性疾病比如系统性红斑狼疮、自身免疫性脑炎等,也是发热待查患者的常见病因。


b) 肿瘤。比如血液系统肿瘤、肾上腺样瘤、胃肠道肿瘤(尤其是结直肠肿瘤)、中枢神经系统肿瘤等,均会引起患者发热。随着CT、MRI等影像学技术的发展和普及,相对易于发现。


c) 其他疾病。比如药物性发热、肉芽肿性疾病、栓塞性静脉炎、溶血、隐匿性血肿、周期热、伪装热等。


可以看出,因患者发热、头痛、淋巴结肿痛等疑似感染症状而送检宏基因组测序,如果返回结果为阴性,临床首先需要进行鉴别诊断,排除非感染因素的可能。


No.2

患者症状由感染性疾病引起


宏基因组检测未发现病原体,为假阴性结果。大致由以下几类原因造成:


a) 送检样本不合理,未靠近患者病灶部位取样。

比较常见的比如肺炎患者送检外周血,宏基因组测序为阴性。在对样本类型进行选择时,应结合患者的实际情况,尽量接近原发病灶取样,提高检测灵敏度。以肺部感染为例,宏基因组的检出率排序由高到低大致为:肺组织>肺泡灌洗液>痰液>咽拭子>外周血。


b) RNA病毒感染,但选择了DNA检测项目。

RNA病毒在呼吸道和中枢神经感染中较为常见,如果患者是RNA病毒感染却选择DNA检测项目,其检测结果必然为阴性。

临床常见的RNA病毒有:

①副黏液病毒科如麻疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞病毒等;

②正黏液病毒科如流感病毒A、流感病毒B、流感病毒C等;

③逆转录病毒科如人类免疫缺陷病毒(HIV);

④小RNA病毒科如甲型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、 鼻病毒等;

⑤黄病毒科如流行性乙脑病毒、丙型肝炎病毒等;

⑥披膜病毒科如风疹病毒;

⑦冠状病毒如SARS冠状病毒;

⑧沙粒病毒科如LCM病毒;

⑨呼肠弧病毒科如轮状病毒;

⑩布尼亚病毒科如汉坦病毒;

⑪纤丝病毒科如埃博拉病毒(EBoV)等。

c) 不同样本类型,人源背景比例不同,导至检测灵敏度有区别。

宏基因组检测是对样本中的总核酸进行鸟枪法(shotgun)测序,样本中提取的核酸同时包含了来源自微生物和宿主的核酸(人源背景)。因此,在不使用特殊的技术手段去除宿主核酸和同等的测序数据量的前提下,样本中人源背景越高,微生物序列也就越少、敏感性越低。


① mNGS检测的敏感性理论估计

假设环境中所有核酸的长度为G,检测其中片段的大小为M,将基因组随机打断,从里面抽取一条reads,正好来至于待检片段的概率为M/G,抽取n条序列,至少有一条序列来至于待检片段的概率为1 - (1-M/G)^n。


假设环境中所有的核酸由k个不同基因组大小Gk的片段组成,每个基因组在环境中的拷贝数为Ck,假定待检片段M=C0G0,环境中总核酸G=∑ Ci Gi。


当样本中含有高背景人源DNA时,G≈背景基因组大小乘以背景细胞拷贝数=C1G1。


检测n条序列其中包含1条以上目的片段的敏感性为:1 - (1-M/G)^n =1 - (1-C0G0/ ∑i=1,k CiGi)^n ≈ 1 - (1-C0G0 / C1G1)^n。

备注:G1为人基因组大小3GX2=6G,细菌按照基因组大小5M计算。


② 不同样本的理论背景及灵敏度

不同临床样本中所含的人源背景不一样,以肺泡灌洗液(BALF,每毫升中参考背景有核细胞数为10^5个)和血液(每毫升中参考背景细胞数为(4 ~ 10)×10^6个)为例,计算其在25M reads下含不同微生物拷贝数时的检测灵敏度。结果显示,如要达到87.5%以上的灵敏度,每毫升BALF中至少需含有10个目标拷贝数,而每毫升血液中至少需含有400个目标拷贝数。





检测案例


No.1

非感染性疾病


29岁男性患者,因“反复咳嗽数月、加重2月”入院。血常规检测结果为:WBC 7.1*10^9/L,淋巴细胞 2.04*10^9/L,中性粒细胞 4.05*10^9/L,血沉 13mm/h。临床诊断为肺炎,纵膈淋巴结肿大,并给予头孢地尼进行药物治疗,已口服5天。


通过PDC-seq™对患者的肺泡灌洗液样本进行DNA+RNA检测,未发现病原体。临床反馈该患者为结节病,阴性结果与临床情况符合。


No.2

RNA病毒感染


61岁男性患者,因“发热伴血小板减少5天”入院,血常规检测结果为WBC 1.37*10^9/L。


通过PDC-seq™对患者的外周血样本进行DNA检测,未发现病原体;对相同样本进行DNA+RNA检测,结果提示新型布尼亚病毒。新型布尼亚病毒是一种RNA病毒,因此DNA检测结果为阴性。


No.3

不同类型样本,检测灵敏度不不同


80岁女性患者,因“结肠癌术后、慢阻肺”入院,血常规检测结果为:WBC 17.9*10^9/L,PCT 1.5μg/L,淋巴细胞1.33*10^9/L。


通过PDC-seq™对患者的外周血样本进行DNA检测,未发现病原体;对其肺泡灌洗液样本进行DNA检测,结果提示鲍曼不动杆菌、脑膜炎败血伊丽莎白菌和纹带棒杆菌。


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