行研丨单细胞多组学高通量测序平台

《单细胞多组学高通量测序平台》

1 单细胞多组学高通量测序技术简介

    1.1 单细胞组学技术发展历史

    1.2 以RNA-seq为例介绍高通量单细胞测序技术

    1.3 其他单细胞测序技术

2 高通量多组学单细胞测序平台的应用

    2.1 以研究为目的的应用

    2.2 以临床为目的的应用

    2.2 以工业为目的的应用

3 竞争格局

通过测序手段检测细胞多层次信息，如基因组、表观组、转录组甚至蛋白组已经成为生物学研究的重要手段。几乎一切生命体的活动都围绕着DNA->RNA->蛋白质的过程，而现有的组学技术也围绕这一过程获取信息（如DNA层面的基因序列），从而解读生物体运行机制，应用于疾病的诊断和治疗中。

多组学研究肿瘤 探针资本整理

探针资本根据公开资料整理

通过多维的测序技术可以获得组织样品的基因表达、调控信息，然而组织中仍有不同功能、形态的细胞，通过大量细胞混合样品测序只能得到组织的平均状态，而无法获得每个细胞的信息，为了解决这一问题，各个组学技术的单细胞测序技术应运而生，并且在近10年的发展中有了突破性进展，被广泛应用于肿瘤研究，甚至临床应用中。

2010-2019年PubMed “single cell sequencing cancer”主题文献数量 探针资本

1.1单细胞组学技术发展历史

单细胞组学技术中以单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing）应用最为广泛。蛋白质是生命活动的承担者，而蛋白质的时空表达等信息均可由RNA反映，所以通过检测细胞内RNA的表达可以有效反映细胞状态。自从1991年第一篇使用array技术测量RNA表达的文章发表以来，对转录组（狭义上则指细胞所能转录出的所有信使RNA，mRNA）的研究技术经历了Array（1991）-> RNA sequencing（2008）-> single-cell RNA sequencing（2009）的发展历程。目前针对不同需求，呈现RNA sequencing和single-cell RNA sequencing并存的状态。

测序方法发展史 资料来源：Molecular Cell 探针资本整理

虽然single-cell sequencing的方法仍在不断推出，但是目前使用最为广泛、商业化成熟的方法仍是10×Genomics公司推出的ChromiumTM系统。

1.2以RNA-seq为例介绍高通量单细胞测序技术

单细胞测序的最主要难点是如何在短时间内分离得到最可能多的单个细胞，早期的技术代表Fluidigm C1平台大约在几个小时中可以捕获96个左右的细胞，之后再进行建库和测序。而现在主流测序平台10×Genomics则是基于类似2015年发表的drop-seq技术原理得到单细胞，细胞准备时长在2小时左右，可捕获500-10000个细胞，在时长和细胞数量上都远远优于C1技术。

1.2.1 10×Genomics技术介绍

10×Genomics公司推出的ChromiumTM系统其技术核心是油滴包裹的凝胶珠（Gel Bead in Emulsion, GEM）。该技术可以解决核心难点：快速高效分离细胞并将细胞和下一步反应所需试剂混合。该系统有75万种带有条形码的凝胶珠（barcoded gel beads），每个凝胶珠上有40-80万探针。每个探针含有四段各司其职的重要序列，下面对四段序列一一介绍。

凝胶珠示意图 图片来源：10×Genomics文档 探针资本

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带有条形码的凝胶珠通过横向孔道进入微流体“双十字”交叉系统，在第一个十字处，细胞通过纵向孔道运至交叉处，细胞与凝珠通过碰撞吸附在一起，继续行进至第二个十字处，进入油相，包裹形成油滴。通过此过程完成单细胞的分离和混合反应试剂的重要步骤，即含Barcoded RT Primers的Gel Beads、细胞和酶的混合物，三者结合形成GEMs，即包裹Gel Beads、细胞和酶的混合物的油滴。

10×系统GEM形成流程 资料来源：10×Genomics官网 探针资本

GEM形成后，细胞裂解，通过一系列反应构建文库，构建好的文库即可通过高通量测序仪测序获得序列信息，根据序列的BC可将序列分至一个个单细胞，根据UMI，可去除掉PCR扩增引入的重复，获得每个基因的准确表达量。具体建库流程如下：1）凝胶珠溶解释放大量barcode序列；2）随后mRNA逆转录产生带有Barcode和UMI信息的cDNA；3）油滴破碎，cDNA为模板进行PCR扩增；4） cDNA打断、加测序接头等传统二代测序的建库过程。

10×单细胞建库流程框架 探针资本整理

10×单细胞建库流程 10×Genomics官网 探针资本

1.2.2其他主流技术介绍：BD Rhapsody平台

BD在单细胞捕获时不再采用微流控孔道技术，而是使用CytoSeq蜂窝板技术，通过超过量的微孔保证细胞极大概率被单个投入微孔中，从而达到了分离单细胞的目的。在分离得到单细胞后，进行细胞裂解，反转等常规建库流程。

BD Rhapsody平台 单细胞mRNA抓取过程 图片来源：烈冰科技

1.3其他单细胞测序技术

1.3.1 Single-cell ATAC-seq

染色质开放性测序技术（Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing，ATAC sequencing）是借助转座酶获得染色质开放性区域序列的高通量测序技术。该技术于2013年，由美国斯坦福大学的William Greenleaf教授研发。基因表达需要相关蛋白（转录因子TF）结合染色质DNA，打开DNA双链之后，再由RNA合成酶介导合成RNA。染色体绝大部分区域是紧密折叠的，仅有一小部分比较松散，而这部分松散（开放、易接近）区域往往是转录发生调控区域，是研究基因表达调控的重要区域。转座酶可以接近并且结合在松散DNA上，通过改造使其携带并将接头序列插入在基因组的开放区域，再通过特异性结合接头序列的引物扩增片段，高通量测序之后便可获得转录因子结合位置，开放程度等转录调控的关键信息。

ATAC Sequencing 原理 图片来源：Genewiz 探针资本

10×Genomics开发的The Chromium Single Cell ATAC Solution是基于Chromium系统，思路与单细胞转录组测序相似，不同之处是样品为细胞核，并且在制备样品时加入转座酶进行插入和连接接头步骤，之后使用相同的流程完成单细胞核建库。

10×Genomics ATAC-seq 流程 图片来源：10×Genomics官网

1.3.2单细胞甲基化测序

DNA甲基化（DNA methylation）是DNA化学修饰之一，指DNA的CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位在DNA甲基化转移酶的作用下，共价键结合一个甲基基团。DNA甲基化是研究最为广泛的表观修饰，DNA甲基化修饰的存在使得相同序列可以具有不同功能，获得修饰的胞嘧啶所在区域的结构、DNA构象和稳定性等都会受到改变，从而影响基因表达。

DNA甲基化修饰（DNA methylation）检测方法按照是否使用亚硫酸盐可以分为两类，其中金标准是亚硫酸盐测序（bisulfite sequencing）。DNA经亚硫酸盐处理后，非甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。经过PCR扩增、测序等步骤，并与参考序列（未经处理）的序列进行比对，若参考序列为C，而测序结果中为T，则判断是未发生甲基化的位点；参考序列和测序结果均为C，则判断是发生甲基化的位点。

亚硫酸盐测序示意图 图片来源：diagenode官网

由于亚硫酸盐会导至DNA降解，使得单细胞水平低起始量的甲基化测序难以实现。直至2013年，汤富酬团队发明了单细胞RRBS（single-cell Reduced representation bisulfite sequencing）技术。该技术通过将所有反应整合在一个体系中完成优化了实验方法。

Single-cell RRBS流程 图片来源：Genome Research

虽然亚硫酸盐导至DNA降解的问题被缓解，但其仍然存在，并且不同位点转化的比例差异较大，使得检测得到的结果并不稳定。而利用APOBEC胞嘧啶脱氨酶选择性将没有修饰的C变为U，最终测序为T，与参考序列比对，则可得到甲基化位点。该方法使用甲基化修饰酶对DNA损伤小，但由于酶对于C的修饰效率受限，基于酶的测序方法需要根据片段大小调整酶量，从而获得较高的分辨率。

亚硫酸盐测序和Enzymatic Methyl-seq对比

图片来源：New England Biolabs 官网

1.3.3单细胞蛋白组测序

质谱（Mass Spectrometry，MS）是目前最常使用的蛋白质组学分析技术，它无需标记，可分析整个蛋白质组。然而质谱的灵敏度不高，检测群体细胞蛋白质组时，通常需要上万个细胞的蛋白总量，所以在检测单细胞时，由于单个细胞内蛋白质含量大大降低，使用质谱法检测单细胞蛋白质组仍需要方法上的改进。

2011年，来自斯坦福大学的Sean C. Bendall等人结合质谱技术和流式细胞技术，发明了质量流式细胞术（CyTOF），其原理如图所示，首先利用含不同过渡金属同位素标签的抗体标记细胞内的特定蛋白，被标记好的细胞随后进入质谱流式细胞仪，逐个喷出单细胞微滴，进入电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）装置，通过定量过渡金属元素标签从而得知每个细胞中各个结合蛋白的含量。由于金属离子的非特异性结合极低，方法的敏感性大幅提升。

CyTOF技术流程 图片来源：Proteomics