结直肠癌cfDNA，黄金时代是否已来？

液体活检是一种利用高通量测序技术来检测血液中小DNA碎片的新技术。从最简单的层面上来说，液体活检指的是分析体液中的肿瘤衍生物质，包括对血液及其他体液的分析，例如唾液、尿液和粪便。液体活检分析的肿瘤衍生物质除了ctDNA外，还包括循环肿瘤细胞、外泌体等。cfDNA和ctDNA都是血液生物标志物，两者之间有重要区别。cfDNA是细胞（包括癌细胞和正常细胞）凋亡后释放入外周血的DNA片段，ctDNA是肿瘤细胞破裂后释放入外周血的DNA片段。因此，只有一部分cfDNA可能是肿瘤衍生的ctDNA。cfDNA的肿瘤衍生片段的丰度可以非常微小、仅占百分之几，仅在某些情况下可以代表大部分cfDNA。但是在绝大多数患者中，cfDNA的肿瘤衍生成分占比都相对较低，因此，需要开发专门的技术以在体内正常cfDNA的背景中检测这些罕见的肿瘤衍生的改变。该领域已经开发了许多应用来识别点突变、拷贝数改变、基因融合、甚至表观遗传变化，如DNA甲基化。

我今天要关注的是从诊断到癌症治疗过程中ctDNA的应用。随着ctDNA检测敏感度的提高，一旦患者患上癌症，实际上可以检测到这些患者中很大一部分中存在的ctDNA。因此，ctDNA实际上是一种潜在的非常强大的生物标志物，在早期疾病的治疗中就用得到。对于结直肠癌患者，手术切除是获得治愈的唯一方法。从理想状态上来说，如果能在肿瘤可切除时得到及时诊断，并切除每个肿瘤细胞，患者就会得到治愈。但正如我们所知，手术后仍有一定比例的患者有癌细胞残留。目前，我们是根据历史复发率来决定患者是否应该接受辅助治疗。但实际上，ctDNA正在成为一种潜在的有力预测因子，可以识别出手术后存在微小残留病灶的患者，从而帮助我们更好地做出是否进行辅助治疗的决定。对于转移性结直肠癌患者，ctDNA也有许多应用，在患者的整个治疗过程中，ctDNA的丰度可以提示该患者的肿瘤是进展了还是对治疗有反应，ctDNA可以作为治疗有效或治疗失败的早期指标。

虽然二代测序技术已有了很大进展，但有大约10％~15％的患者缺乏足够的组织用于二代测序，而且活检为创伤性检查，缺乏安全性。通过ctDNA进行二代测序是一种非常有效的识别基因变异从而指导治疗的方法。那么，来自cfDNA的数据是否可靠？许多研究都考察了血浆和组织检测的一致性。总体来说，特别是对于结直肠癌，如果在适当的时间抽取样本（这确实是关键）——在治疗之前或治疗之间，而不是在接受治疗时，因为治疗时ctDNA的水平会受到抑制，血浆和组织检测之间的一致性非常好。因此，对于无法基于组织进行测序的患者来说，这是一个可以使用的方法。当我们根据ctDNA结果做出治疗决策时，要记住，有10%~15%的患者ctDNA水平可能太低而无法检出，因此即使检测结果阴性也不能排除基因变异的存在。

在既定的患者中，随着时间的推移，其体内ctDNA的数量会越来越多，因此ctDNA水平是反应疾病负担的非常准确的标志物。现在有很多研究正在考虑实时追踪ctDNA水平，以预测患者是否在早期对治疗做出反应。

Aparna Parikh做了一项研究，她在基线时和在开始治疗后4周分别检测患者的ctDNA水平，发现与治疗无获益的患者相比，对治疗有反应或疾病稳定的患者通常在治疗的非常早期ctDNA水平就明显下降。ctDNA下降程度没有达到一定水平的患者没有从治疗中获益。值得注意的是，经过短短几周的治疗，就可以挑选出治疗有效的患者，其中没有一例患者治疗超过4个月，而PFS就已经出现了非常显著的差异，ctDNA下降＜30%的患者中位PFS仅2.0个月，而ctDNA下降＞30%的患者中位PFS达7.5个月。

新的治疗方法如靶向治疗和免疫治疗确实为患者带来了非凡的治疗反应，但这些疗法几乎很快就会出现获得性耐药。我们是否可以通过评估患者的肿瘤基因组而提出可以克服耐药并延长治疗反应的后续疗法？

当前，虽然对肿瘤进行分子分型的主流方法是肿瘤组织活检，但肿瘤存在异质性的问题。一种是病灶间异质性，患者体内的不同转移性病灶可以独立发展，并形成完全不同的耐药机制。另一种是病灶内异质性，在同一病灶内的肿瘤亚克隆也可以形成不同的耐药机制。因此，如果我们仅对一个转移灶的一个位点进行活检，那么对这个患者的耐药机制的了解就会非常有限。

这就是cfDNA真正成为一种有价值的工具的地方。由于ctDNA是由全身的肿瘤细胞脱落形成，我们可以对患者的耐药机制获得更完整的视图，而不受活检地理点的限制。如果我们仅对这些病灶中的一个进行活检并选择仅基于这一个活组织检查的治疗，我们可能会很好地治疗这个病灶，但其他耐药机制驱动形成的病灶可能对该治疗并无反应。如果我们能够在整个治疗期间追踪ctDNA，不仅可以看到患者ctDNA水平的轨迹——ctDNA最初下降，然后在疾病进展时开始上升，也可以了解疾病全程中患者的肿瘤负担，或许可以帮助我们更明智地选择后续治疗。

我们小组的Larry Blaszkowsky博士曾治疗过一例RAS野生型结直肠癌，患者有大约一年半的时间表现出惊人的治疗反应。不幸的是，该患者最终进展。在进展时，我们对一个快速生长的肝脏病变进行了活组织检查，发现了EGFR下游MEK1的一个激活突变，这个突变降低了癌细胞对EGFR通路的依赖。我们以EGFR抗体联合MEK抑制剂来治疗这名患者，约2周后，患者的肿瘤标志物明显下降，P53也明显下降。但不幸的是，P53后来又开始上升，表明患者的肿瘤负担整体进展。有趣的是，我们检测到了在先前肿瘤活检中发现的相同的MEK1突变，然后我们通过治疗非常好地抑制了这个克隆。但是令人惊讶的是，患者后来又出现了KRAS突变，该突变对上述治疗无效，这个克隆生长得非常快，推动了患者的疾病进展。

事实上，我们发现携带MEK1突变的病变对我们围绕该突变设计的治疗反应非常好。但其周围的许多其他病变增长非常迅速。如果当初我们把穿刺针放在几厘米远的病灶里，我们可能会想出一种完全不同的疗法。不幸的是，这并不是个案，而是常态。

Duke大学的John Strickler和MD Anderson的Scott Kopetz研究了一个来自结直肠癌患者的cfDNA的大型数据库，分析了经过抗EGFR治疗的42名患者的cfDNA，发现患者在抗EGFR治疗后，可以出现多达13种不同的耐药机制，涵盖多个功能类别，只有大约10％的患者只有一个功能类突变，这表明选择一个通用的治疗方法将非常困难。

麻省总院设立了一个系统性的程序，对治疗中的患者进行连续跟踪，以真正理解异质性带来的问题。Aparna Parikh对正在接受靶向治疗和/或免疫治疗或研究性治疗的胃肠道肿瘤患者进行连续追踪，检测其ctDNA，并将其与匹配的肿瘤组织活检进行对比，发现了二者之间的惊人差异。通过ctDNA发现实验室已验证的耐药机制的几率比通过肿瘤组织活检发现的几率要高得多，而且，以ctDNA和组织活检这两种方法识别出的有多种耐药的病例数量也明显不同。Aparna Parikh分析的44例患者的数据中，ctDNA检测显示大多数病例的突变多于1种，每例患者从2到9不等，中位数为3。在23例配对的肿瘤组织活检中，只在2例患者中发现了多种耐药机制，每例只有2种突变。同时，进行ctDNA和肿瘤活检的这23例配对病例中，在ctDNA中发现的临床相关的耐药机制，有78％在配对肿瘤组织活检中并未找到，因此ctDNA正在成为评估肿瘤在治疗开始后获得性耐药机制的更合适的方法。

ctDNA对于评估肿瘤在治疗后如何发展也非常有用。Alberto Bardelli和他的团队研究发现，在完成EGFR抑制剂的初始治疗之后，检测到了KRAS突变——如果停止抗EGFR治疗并给予不同的治疗，耐药机制往往会衰退，然后就可以重新启用EGFR抗体，在许多情况下，肿瘤可以得到再次缓解。Christine Parseghian和Scott Kopetz的研究表明，在停止EGFR治疗后，RAS突变和/或细胞外EGFR突变等耐药机制在3~6个月的半衰期内衰退。现在有一些临床试验在停止抗EGFR治疗后重新分析cfDNA，以找到那些可能从再次挑战抗EGFR治疗中受益最多的患者。

尽管手术是治愈患者的方法之一，但我们无法知道谁治愈了，谁在身体某处残留着现有手段无法检测到的肿瘤细胞，因此我们只是根据历史趋势而不是最新数据做出决策。例如，在低风险或平均风险的Ⅱ期患者中，一般的做法是不给予化疗，即使这些患者中约10％~15％最终会复发。如果我们找到这些患者并对其进行治疗，可能在很大程度上实现治愈。另一方面，在Ⅲ期结肠直肠癌中，一般每个人都接受化疗，尽管超过一半的患者仅仅通过手术就可以治愈，却要接受长达6个月的强烈而有毒的治疗。

如何克服这个难题呢？ctDNA确实有可能改变我们处理早期疾病的方式。如果我们观察手术切除的肿瘤并确定特定的突变和/或其他特定于该癌症的改变，就可以将它作为分子指纹使用，并在手术后几周内观察分离的cfDNA，如果患者的血液中存在相同的肿瘤特异性突变和/或改变，则可以直接证明这些患者有残留病灶，并且可能会复发，如果不进行干预，可能会死于疾病。

澳大利亚的Jeannie Tie和Peter Gibbs在与霍普金斯的一个小组进行的一项具有里程碑意义的研究中表明，手术后可检测出ctDNA的患者几乎总是会复发，与ctDNA阴性的患者之间存在非常显著的差异，这远远超过目前的临床危险因素和肿瘤标志物对复发的预测价值。遗憾的是，虽然ctDNA的特异性非常好——也就是说如果我们确实检测到ctDNA，那么就可以确信那些患者会复发并且应该接受治疗，然而，在现有技术下，有相当大比例的复发患者会被遗漏。因此，这个领域还有很多工作亟需开展，以提高检测的灵敏度，方法之一就是不仅要看肿瘤突变，还要看其他标志物，包括DNA甲基化和其他表观遗传学标志物。

我们认为，治疗早期疾病的模式确实有能力改变，我们可以通过评估患者的肿瘤而不是根据历史趋势来制定患者的治疗策略。在治疗后早期进行检测，并且在患者的随访期间继续进行检测，以找到可能仅适合观察的患者，并且使那些具有明确的残余疾病证据的患者从额外的治疗中获益。有两项研究正在进行中，其中一项由Van Morris领导的合作小组进行，将ⅡA期结肠癌患者在术后随机分组，一组接受标准的随访监测；另一组予ctDNA检测，阳性者接受辅助治疗，阴性者给予随访监测。Parikh博士的研究则将接受了手术和标准辅助治疗的Ⅲ期结直肠癌患者给予ctDNA检测，阴性者予观察随访；阳性者中，具有特定分子亚型的患者给予相应的靶向或免疫治疗，其他患者则随机接受化疗或随访观察。

总而言之，对于识别可作为靶点的基因变异来说，ctDNA的黄金时代已来，这一应用已进入临床，那些肿瘤组织质量不佳无法进行基因测序的患者尤其应考虑使用。ctDNA预测治疗反应的价值仍在研究中，黄金时代有望很快到来。监测耐药性是我们现在可以做的事情，这既要考虑治疗方案再挑战的能力，又要了解如何选择最佳治疗方案。再次，在未来数月的某个时候，检测残留疾病的试验也将开始。我认为，ctDNA检测不止是使患者生存期延长几个月这么简单，更有望治愈更大比例的患者，这个愿望的实现已为时不远。