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蛋白类血清肿瘤标志物检测标准化现状

2019-7-10| 编辑: 小桔灯网| 查看: 525| 评论: 0|来源: 检验科空间

摘要: 作者:杜利军 张乔轩汤君翊 韩丽乔 黄宪章肿瘤标志物是指由肿瘤细胞产生或诱导产生的反映肿瘤生产和(或)活动的一系列分子,具有广泛的特征,可用于了解肿瘤的发生、发展和疗效观察。但这并不意味着肿瘤标志物是肿 ...

 

作者:杜利军 张乔轩 

汤君翊 韩丽乔 黄宪章


肿瘤标志物是指由肿瘤细胞产生或诱导产生的反映肿瘤生产和(或)活动的一系列分子,具有广泛的特征,可用于了解肿瘤的发生、发展和疗效观察。但这并不意味着肿瘤标志物是肿瘤组织特异的,大多数肿瘤标志物也可由正常组织产生,因此,肿瘤标志物的特异性与其存在的浓度高低有关[1]。提高肿瘤标志物的定量准确性,使不同检测方法和不同厂家试剂盒之间的检测结果等价可比,即实现肿瘤标志物测量标准化,对于建立肿瘤标志物的参考值,提高临床对癌症的诊断具有非常重要的意义。按照标准化、一致化的定义和国际标准化组织(International Organization for Standardization,ISO)17511对计量溯源性的分类,标准化和一致化都要求被测量的结果在不同检测系统之间是等值的。但在测量过程中,标准化要求其能够通过一级参考测量程序和(或)一级参考物质溯源至国际单位制,一致化则可通过将被测量溯源到某一参考物质或者协商一致的方法来实现,并不能溯源至国际单位制单位[2]。然而,临床上可作为肿瘤标志物的指标种类较多,包括酶和同工酶类、激素类、胚胎抗原类、糖链抗原类、蛋白类和癌基因产物类等,且具有不同的功能。由于肿瘤标志物的复杂性,目前绝大多数没有参考方法,也仅有部分项目有国际约定的校准品(非一级),若要实现标准化,需要克服这些困难。临床检验标准化涉及分析前、分析中、分析后全过程,本文将主要介绍肿瘤标志物测量过程,即分析中的标准化与一致化现状。

 

一、肿瘤标志物测量标准化存在的主要问题和研究现状


根据国内公布的临床肿瘤诊疗指南和规范,本文按肿瘤类型对血清肿瘤标志物进行了归纳,见表1。多数肿瘤标志物是结构复杂的生物大分子,在不同临床条件下形成多种糖基化、络合物、异构体等不同的分子形式,测量对象的分子结构和存在形式的定义不够充分。这类肿瘤标志物的临床测量均是基于免疫学技术,仍没有高准确性且国际公认的参考方法,是阻碍其测量标准化存在的主要问题。为了实现检验项目的标准化与一致化,国际临床化学和实验室医学联合会分别成立了检验医学溯源联合委员会(Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine,JCTLM)和一致化监督组两个组织,前一个组织关注于能够建立完整参考测量系统的具有明确定义的被测物,后一组织则关注于短期内还不能建立参考测量系统的那些不能被明确定义的被测物[3]

 

表1 国内相关行业指南推荐的肿瘤标准物


对于复杂的生物大分子化合物,JCTLM及相关组织也在研究其具体的被测物结构对其进行明确定义,渴望通过同位素稀释质谱(isotopedilution/mass spectrometry,ID/MS)技术实现参考方法的建立,但仍然处于研究的早期阶段,JCTLM列表上公布的蛋白类生物大分子参考方法中仅有少数采用ID/MS法。对于这类化合物,国际上希望通过协商一致的方法来规范肿瘤标志物的检测结果,先实现一致化。WHO采用多中心合作研究的方式进行国际标准物质的定值[4],这些标准物质已被广泛应用于各试剂生产厂家进行产品校准。1997年欧洲成立了欧洲肿瘤标志物组织,进行临床相关的肿瘤标志物及其检测的质量要求、质量控制和标准化管理。美国临床生物化学学会于1998年召开研讨会起草了肿瘤标志物的分析检测以及临床应用的指导原则。上述组织渴望在现有条件下,通过质量管理和使用国际标准物质等对肿瘤标志物的检测结果进行控制,从而实现检测结果的一致化。

 

二、蛋白类肿瘤标志物参考方法研究现状


(一)临床常规检测方法

蛋白类血清肿瘤标志物的临床检测方法主要有:放射免疫法、ELISA、荧光免疫法和化学发光法等[20]。这些方法均是基于抗原抗体的免疫特异性原理,在此基础上结合放射性检测、酶活性检测、荧光检测和化学发光检测等进行目标分析物的定量检测。然而不同厂家、不同试剂盒使用的单克隆抗体针对抗原的位点不同导至测定存在明显差异,有时使用同一种抗体,也可能因抗原异质性或基质的影响而得到不同的结果。因此,设计并规范能够满足临床诊断需求的肿瘤标志物检测方法,不仅依赖于具有准确校准系统的国际标准品(international standards,IS)和国际参考试剂(international reference reagents,IRR),而且需要选择最适合的抗原抗体组合。为此,国际肿瘤学和生物标志物学会(International Society for Oncology and Biomarkers,ISOBM)协调了许多抗体研讨会,旨在对大多数主要肿瘤标志物的市售抗体和研究抗体的特异性进行表征。面对数以千计的新抗体,ISOBM建立了一个类似于人白细胞分化抗原的网络,用于表征针对"组织分化"抗原的抗体。自1980年开始,ISOBM分别成立了11个工作组,分别针对CA125、AFP、前列腺特异性抗原(prostatespecific antigen,PSA)、人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)、CEA、ALP、SCC等肿瘤标志物进行了抗原抗体特异性的研究[21]。研究特异性的抗原抗体反应的前提是确定明确的分析物,例如hCG在人血清中存在6种不同的分子形式,WHO根据其特定的分子形式分别研制了参考试剂,并在2013年确定了用于测量hCG和相关分子的候选表位,于2016年进行了hCG免疫测定表位标准化的研究[22]

 

(二)ID/MS在蛋白类生物标志物检测中的应用

蛋白类化合物在肿瘤标志物中占比很高,但仍没有国际公认的参考方法。随着ID/MS在蛋白类生物标志物检测中的研究逐渐成熟,有望通过这类技术建立相关肿瘤标志物的参考方法。ID/MS技术由于具有绝对定量的性质,且灵敏度高、方法准确、测量范围宽、测量值能够溯源到国际基本单位制等优点,目前检验标准化领域将其作为公认的一级参考测量原理并用于与参考方法的建立。该方法主要对目标分析蛋白所包含的特征肽段进行精准的定量分析,与目标蛋白的空间构型和存在形式无关,可极大地排除检测过程中存在的干扰。研究表明多重反应监测联合ID-MS,又称同位素稀释液相色谱串联质谱法(isotope-dilutionliquid chromatography-tandem mass spectrometry,ID-LC-MS/MS)是非常适合用于临床复杂生物样本中蛋白/肽绝对定量的方法[23],其研究的核心是目标肽段及稳定同位素内标的选择。

 

采用ID-LC-MS/MS技术建立的C肽和Aβ42等蛋白类生物大分子化合物的检测方法于2013年被JCTLM列入了参考方法,证明了使用ID-LC-MS/MS建立蛋白类生物大分子化合物参考方法的可行性,为肿瘤标志物的标准化提供了可借鉴的途径。根据同位素内标种类的不同,基于ID/MS定量蛋白/肽的方法分为4类:标记肽段作为内标的绝对定量法、标记多肽作为内标的定量串联体法、蛋白质标准物绝对定量法和细胞培养稳定同位素标记定量法(stable isotope labeling with amino acids in cell culture,SILAC)。目前已建立的ID-MS法定量检测蛋白/肽包括:PSA、IgG、CRP、C-肽、β淀粉样肽(1-42)(Aβ42)[24]等。其中仅C-肽和Aβ42被JCTLM收录为参考测量程序。除PSA和IgG外,还未见ID-MS法定量检测其他蛋白类肿瘤标志物的报道,且没有基于ID/MS定量肿瘤标志物的方法被列为参考方法。SILAC是目前最准确的生物样本中蛋白定量的方法,最有望成为正式的参考方法。尽管使用SILAC进行完整蛋白同位素标志物的研制仍有一定的困难,主要是因为完整蛋白内标制备和纯化的过程复杂,但若要建立相关肿瘤标志物的参考测量程序,通过SILAC联合氨基酸分析法准确定量生物样本中的蛋白类肿瘤标志物是一条可靠途径。总之,就目前的研究现状而言,仍没有国际公认的蛋白类肿瘤标志物的参考方法,是阻碍肿瘤标志物检测标准化存在的主要问题。

 

三、标准物质研究现状


蛋白类肿瘤标志物由于没有国际公认的参考方法,为了规范试剂厂家对这类肿瘤标志物的检测结果,目前国际上多采用多中心合作研究的方式进行国际标准物质的定值。临床使用最为广泛的标准物质主要由WHO提供。WHO研制的相关肿瘤标志物的标准物质和试剂包括:IS、国际参考制剂和IRR[4]。另外,中国食品药品检定研究院和中国计量科学研究院也进行了相关肿瘤标志物的标准物质研制工作。但是蛋白类肿瘤标志物种类繁多,目前公认的国际标准物质仅有CEA、AFP、游离PSA、t-PSA、铁蛋白、hCG、hCGn、hCGα、hCGβ、hCGβn、hCGβcf等有限的几种,因此仍需要多中心协作,进一步研制公认的标准物质。

 

四、其他血清肿瘤标志物标准化现状


虽然绝大多数肿瘤标志物没有国际公认的参考方法,但仍有少部分酶类标志物如乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)等拥有国际约定的参考方法,且研制了相应的标准物质:LDH血清基质标准物质ERM-AD453和含有ALP的复合血清标准物质JCCLS-CRM001b,能够实现标准化。另外,利用ID-MS对于儿茶酚胺激素类小分子化合物的定量检测也相对成熟。但由于方法性能未达到参考方法要求,均未被列入国际参考方法目录。随着分子生物学技术的不断发展,以检测游离核酸作为分子诊断标志物的液体活检技术得以实现,且日益受到关注。游离核酸分子标志物的研究在肿瘤早期诊断、治疗监测和预后评价等方面具有重要的临床意义。采用潜在的核酸绝对定量方法(如数字PCR方法)对核酸标准物质进行定值,可以通过标准物质实现常规定量方法测量结果向国际单位制的溯源,保证临床诊断核酸定量测量结果的准确可靠、可比和可溯源,有望实现核酸检测的标准化。

 

五、结语


综上,目前血清肿瘤标志物除少数酶类外,其他项目均无国际约定的参考测量程序,部分肿瘤标志物有国际约定的校准品(非一级)。就目前基于免疫技术的检测方法而言,设计规范的方法以满足肿瘤标志物检测的临床要求,不仅依赖于研制恰当的能够进行校准的国际标准品和参考试剂,而且还依赖于选择适当的抗体组合,以提高检测方法的准确性,从而确定公认的参考测量方法。值得注意的是,2013年以后加入JCTLM列表的C肽等蛋白类生物大分子化合物的参考方法均采用ID-LC-MS/MS法,因此应用基于该方法的蛋白/肽检测方法能够准确定量生物样本中的蛋白类标志物,为生物样本中蛋白类肿瘤标志物参考方法的建立提供了一条可供参考的有效途径,而且PSA、IgG等血清肿瘤标志物也已建立了基于ID-MS的检测方法,在实现标准化的道路上已取得了一定的进步。就目前肿瘤标志物的标准化和一致化现状而言,通过各国学者的不懈努力已取得了一定成绩,但真正实现标准化还任重道远,特别是游离核酸肿瘤分子诊断标志物。因此,在国际上还没有公认的参考方法和国际标准品种类很少的情况下,做好实验室室内质控是确保检测质量的重要保证。



选自中华检验医学杂志2019,42(1)

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