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看完此文,别再说不懂1/2/3代PCR技术

2019-7-10| 编辑: 小桔灯网| 查看: 457| 评论: 0|来源: IVD从业者丨作者:锁炎

摘要: Mullis在发明PCR技术后曾这样描述:“用一个单分子DNA,PCR能在一个下午内产生100百万个相似的分子。只需要一个管子、一些简单的试剂和一个用来加热的设备”。从PCR技术发明至今已过30年,而PCR技术刚好发展到第三代 ...

Mullis在发明PCR技术后曾这样描述:“用一个单分子DNA,PCR能在一个下午内产生100百万个相似的分子。只需要一个管子、一些简单的试剂和一个用来加热的设备”


从PCR技术发明至今已过30年,而PCR技术刚好发展到第三代,在过去的30年里PCR技术为生命科学的发展做出了不可磨灭的贡献。


◆◆
一代PCR
◆◆


通常我们说的第一代PCR技术就是最初的PCR,采用普通PCR扩增仪来对靶基因进行扩增,然后采用琼脂糖凝胶电泳对产物进行分析,只能做定性分析。


技术原理图解

扩增原理


技术应用

能将微量的 DNA 大幅增加。因此化石中的古生物残骸,犯罪现场的毛发、皮肤碎屑或血液只要能分离出一丁点的DNA,就能用PCR加以放大,进行比对。


技术优势

PCR 是一种用于放大扩增特定的 DNA 片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊 DNA 复制


技术缺点

1. 最初的PCR技术所采用的核酸染料,会对实验人员和环境造成伤害

2. PCR完成之后需要开盖检测,容易发生污染造成假阳性结果

3. 检测耗时长,操作麻烦,容易出错

4. 只能做定性检测


◆◆
二代PCR
◆◆


第二代PCR就是荧光定量PCR技术(Real-Time PCR),也叫做qPCR, 荧光定量PCR通过在反应体系中加入能够指示反映进程的荧光探针,通过荧光信号的积累来监测扩增产物的积累。通过荧光曲线来判断结果,并可以借助Cq值和标准曲线来定量。


技术原理图解


技术应用

用于传染性疾病病原体检测,疾病耐药基因研究,药物疗效考核,遗传疾病诊断


技术优点

1. 污染风险低

2. 操作流程更简单、经济高效

3. 需要的DNA和RNA加样量少


技术缺点

1. 不同厂家生产的试剂和设备所产生的Cq值之间存在一定的差异,并不具备可比性

2. 存在背景值的影响,结果易产生偏差

3. 对于低拷贝的DNA往往难以检测

4. 当反应体系中有PCR抑制物存在时,常规的PCR体系经常会受到影响。


◆◆
三代PCR
◆◆


第三代PCR技术叫做数字PCR(Digital PCR, dPCR, Dig-PCR),这是目前全新的一种PCR检测方式,能对核酸进行检测和定量,采用直接计数目标分子而不依赖任何校准物或者外表,即可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目。


技术原理图解


技术应用

用于大量正常细胞群中检测少数含突变的细胞。通过稀释样品DNA到对应的检测孔中,经过PCR扩增之后,向每个孔里加入特异性荧光探针与产物杂交,然后直接计数样本中突变型和野生型等位子的数量。


主要应用于突变分析、等位基因缺失、混杂DNA的癌症检测等等。


技术优点

1.灵敏度更高

数字PCR将传统的PCR反应分割成了数万个体系,这些体系独立扩增,独立检测,保证了个位数的模板数量都可以被检测到


2.定量更准确

数字PCR通过微体系的荧光计数,直接将反应初始模板数量统计出来,即使某些微滴中的模板数量不止一个,也可以通过泊松分布进行计算。


3.抗干扰能力更强

数字PCR第一步反应体系的分配过程中,会模板和抑制物分配到不同的体系,降低抑制物的干扰。并且,与qPCR不同的是,dPCR检测的是终点荧光,即使微体系稍微受到了影响,也不会影响最终结果的判读。


技术缺点

1.模板质量要求较高

由于数字PCR将反应拆分成了数万个独立体系,因此其对模板量有比较高的要求,模板量超过微体系量会导至无法定量,过少会导至信号过低,降低定量准确度。


2.非特异性产物的判断

数字PCR观测的是每个体系中的终点荧光,无论PCR产物是否是特异性产物,只要荧光信号足够强,也是会判读为阳性结果。因此dPCR的引物特异性要求极高

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