液体活检迎来黄金时间？看2019年ctDNA检测室间质评报告怎么说！

液体活检，顾名思义，就是利用人体体液作为标本来源检测获取肿瘤相关信息的技术，它是一种简单且非侵入性的外科活检替代方法。

美国国家癌症研究所（NCI）的癌症术语词典中，对液体活检是这样描述的：

液体活检，是对血液样本进行的检测，以寻找血液中的循环肿瘤细胞（CTCs）或血液中循环肿瘤NDA（ctDNA）。液体活检可用于癌症的早筛（癌症早筛）。它也可以用来帮助制定癌症的治疗计划（辅助诊疗），或者癌症治疗过程中疗效评估（治疗监测），或者癌症复发转移的评估（预后评估）。随着时间的推移，可以多次采集血液样本进行检测进而帮助医生了解肿瘤中正在发生的分子变化（实时监测）。

▲ NCI癌症术语词典

肿瘤的液体活检主要包括 循环肿瘤DNA/RNA（ctDNA/ctRNA），循环肿瘤细胞（CTCs）及外泌体（Exosomes）等检测，其中ctDNA，CTCs是临床应用比较成熟且最受关注的两类液体活检靶标，其次是外泌体。所以目前肿瘤液体活检的三宝可以精化为 ctDNA，CTCs，Exosomes。

▲ 肿瘤液体活检三宝

ctDNA（circulating tumor DNA） 是肿瘤细胞释放到血液循环系统中的 DNA，是循环游离 DNA（circulating free DNA，cfDNA）或细胞游离DNA（cell free DNA，cfDNA）的一部分。ctDNA 检测，实际上检测的是全部的 cfDNA，再从中分析肿瘤特异的基因变异。侧重于从基因层面获取突变信息，适用于癌症早期筛查，个性化用药指导，耐药性监测，预后判断等。

CTCs （Circulating Tumor Cells）是由实体瘤或转移灶释放的，进入外周血循环的肿瘤细胞，侧重于细胞病理，近年来随着单细胞测序技术的发展，CTCs 的分子图谱分析也越来越火热，CTCs也适用于个性化用药指导及治疗后的病情监测，判断预后等。

Exosomes，即外泌体，是一种能被大多数细胞（包括肿瘤细胞）分泌的微小膜泡，具有脂质双层膜结构，直径大约 30-100nm。外泌体所含信息丰富，包括RNA（miRNA，mRNA等）、DNA、蛋白质等，不仅能用于临床辅助诊断，还可以用于疾病的治疗等，未来发展空间广阔。

▲ 肿瘤液体活检三宝介绍

就目前临床应用来说，ctDNA 是应用最广且最成熟的（较CTCs与外泌体来说），比如癌症早筛，临床用药指导，靶向药物伴随诊断，实时疗效监测，肿瘤进展及不良预后早期预警（检测微小残留病灶），耐药机制探索等。

▲ ctDNA的临床应用方向

ctDNA检测相对于常规传统侵入式组织活检具有非侵入性，患者依从性好，异质性低，可反复取材等优势。并且ctDNA检测应用于NSCLC EGFR靶向治疗伴随诊断已被FDA批准并被NCCN写入指南；ctDNA检测应用于NSCLC EGFR T790M靶向治疗伴随诊断已被NMPA批准上市。

▲ ctDNA作为“液体活检”比传统活检有几个潜在的优势

ctDNA检测是克服肿瘤时空异质性的唯一方案，NGS与液体活检的结合可帮助呈现肿瘤的时空进化全景，给患者不断带来新的治疗希望。

▲ ctDNA是克服肿瘤时空异质性的唯一方案

▲ 患者的克隆演化图：ctDNA不断带来的治疗新希望

ctDNA的检测样本类型有多种，并不是所有的肿瘤患者都推荐使用血液进行检测。考虑到患者病灶累及部位、转移情况的复杂性、不同体液标本的特征，应优先选择液体活检靶标最易检出部位标本（例如广泛腹腔/盆腔转移患者可优选腹水；中枢转移性肿瘤可优选脑脊液等）。

▲ 体液标本选择一般规律

目前，肺癌的大量“必检基因”，如 EGFR、ALK 、ROS1、NTRK等已成为肺癌诊断中的常规检测项目，用于指导靶向用药的选择（NTRK写入2019非小细胞肺癌NCCN V.3指南）。但约 30% 的晚期NSCLC患者没有任何组织样本可用，能够快速有效的解决这些问题，就是ctDNA检测。到目前为止，ctDNA 是唯一被官方批准的可临床应用于 NSCLC 患者的样本。

ctDNA很火，

那么，它迎来黄金时间了么？

借用最新 2019 ASCO 的回答：

还没有，但快了！

因为它的标准制定，

定量、稳定可重复检测，

严格验证及成本效益都还需要解决。

为了解我国临床实验室ctDNA基因突变检测的开展现状及质量状况，国家卫生健康委临床检验中心开展了该项目的室间质量评价计划，看看目前国内各临床检测实验的ctDNA检测能力到底怎么样？

① 2019 ctDNA室间质评：本次质评由国家卫生健康委临床检验中心和澳大利亚皇家病理质控中心联合开展，本次室间质评共5个样本，突变等位基因百分比设置在0.1~10%之间（本次室间质评的检测下限是根据大多数实验室自我宣称的检测下限0.1%~0.5%来设定的）。

② 2019参与ctDNA检测实验室：我国共有来自19个省（市、自治区）的146个实验室参加（北京23家，广东21家，江苏20家，上海19家...），各实验室使用自己的NGS panel进行检测，并报道检出的突变信息即可。

③ 2019 ctDNA室间质评日程安排：

④ 2019 ctDNA室间质评结果：

146家实验室报名参加，其中，16家未回报或未按时回报结果，1家检测方法学不符，2家ctDNA检测下限回报不清，1家使用的检测panel未包含检测突变点，最终有效结果为126个。其中1家实验室出现了核酸提取低于上机检测要求的回报结果（125家核酸提取合格，但有5.27%的实验室提取率低于16.7%，即100ng以下，室间质评提供的cfDNA 在600ng左右，临床样本的cfDNA量通常比质评的cfDNA含量更低，则失败的可能性更大）。

125家实验室有效回报了检测结果：

最终在2019年6月30日，2019 ctDNA室间质评成绩出来了，125家实验室中，总体合格率有 80.0%（99/125），满分通过率的只占 42.4%（53/125）。2018年的ctDNA室间质评中，我国共计116 家实验室参加了，其中采用NGS方法的实验室共66家，有40家满分通过，满分通过率为 60.1% 。（2019年的NGS ctDNA满分通过率下降率近20%！）

本次室间质评，共计报告了173个假阳性突变结果，67个假阴性结果及48个检测下限以下结果报告为阳性的结果：

❶  173个假阳性突变结果，就是本来是阴性的结果，硬生生的给出了阳性的报告！这要是临床报告，是不是在坑人？

❷  67个假阴性结果，就是本来是阳性的结果，硬生生的给出了阴性的报告！这要是临床报告，是不是在坑人？

此次质评要求在检测范围内、检测下限以上的基因突变均要求正确报告（0.1%~10%突变以上），这是一个较低而且符合临床实验室实际检测情况的要求（因为本次室间质评的检测下限是根据大多数实验室自我宣称的检测下限0.1%~0.5%来设定的），但这次室间质评质评评价中，仍有部分实验室对自建方法的检测范围不明确，对宣称检测范围内高突变频率的突变未检出（201914 TP53 R248G 8.72%），这种突变频率远高于1%，这些实验室却不具备对这种突变的检测能力，与其宣称的检测范围严重不符合！可想而知，那些市场宣称 0.01% 检测灵敏度的公司，更多的是吹牛啤~

除此之外，仍有大部分实验室对宣称检测下限（0.1%）附近浓度水平的突变未检出（201912 TP53 R248G 0.12%）和（201913 EGFR L858R 0.12%），这些实验室对性能确认/性能验证方面仍存在很大欠缺。由于临床真实的ctDNA绝对浓度和相对浓度通常较低，因此实验室应更加重视对检测的性能确认/性能验证，以保证每次检测的准确性和可靠性。

❸ 48个检测下限以下结果报告为阳性的结果，就是本来让你报0.1%~10%突变频率以上的突变，结果你非要逞能，在未加说明的情况下，直接对检测下限以下的突变也进行了报告，这反映出这部分实验室仍未具有标准操作程序和性能确认的概念！仅在下机数据中进行 reads 手工审核存在突变reads 并不能真实的反映样本中突变的真实性，存在突变reads可能50%真阳性，可能50%假阳性。

⑤ 对于ctDNA基因突变检测报告的问题：

ctDNA基因突变检测报告是保证检测质量的重要环节，但此次室间质评发现，实验室检测报告中仍存在较多的问题，主要集中在：基因信息部分；结果报告和解释部分；检测方法信息部分及检测性能和局限性描述部分。

总之，此次室间质评活动一定程度上反映了目前我国肿瘤游离DNA基因突变检测的现状以及存在的问题，这些也是目前实验室分子检测的共同问题。另外，此次ctDNA的室间质评只是定性评价，并没有对定量进行评分，只说定量不合格的实验室需进行自我教育...

由此可见，目前市场的ctDNA检测水平差距还是比较大的！参加此次ctDNA室间质评的应该都还是行业内肿瘤基因检测的“领先者”，暂不说室间质评结果如何，至少是有ctDNA这项检测技术的。没有参加此次ctDNA室间质评的第三方医学检验实验室，基因检测公司则更多，很多连ctDNA检测技术都没有，临床怎么做的？

1，有点良心的，外包给这些有ctDNA检测技术的公司，这些有ctDNA检测技术的公司检测怎么样？总合格率80%，满分合格率42.4%；

2，没有良心的，直接采完血就扔了，给你来份0成本的基因检测阳性报告（一份造假的肿瘤基因检测报告造成的后果和引申）；

3，处在有点良心和没有良心之间的，随便自建点试剂，不管检测灵敏度、特异性、性能确认，性能验证，SOP等，随便做，就是要搞劣币驱逐良币。

最后，还是那句话，如此 良莠不齐的市场，鱼龙混杂的产品，怎么保证给患者一个准确可靠的报告？建议大家做ctDNA检测时还是选择专业性强、靠谱且有实力的医学检验实验室（所）吧！如果还不知道怎么选，那就等2019 ctDNA室间质评的结果公布吧（近期将会公布）。本年度的国际肿瘤游离DNA（ctDNA）基因突变检测室间质量评价活动证书将于2019年8月31日前发放。

1.Wan Jonathan C M,Massie Charles,Garcia-Corbacho Javier et al. Liquid biopsies come of age: towards implementation of circulating tumour DNA.[J] .Nat. Rev. Cancer, 2017, 17: 223-238.

2.Abbosh Christopher,Birkbak Nicolai J,Wilson Gareth A et al. Phylogenetic ctDNA analysis depicts early-stage lung cancer evolution.[J] .Nature, 2017, 545: 446-451.

3.https://www.mycancergenome.org/content/page/circulating-dna/

4.Dynamic changes in plasma in NSCLC：ready for prime time？，2019 ASCO

5.《NCCL-I-32-2019肿瘤游离DNA(ctDNA)基因突变检测室间质量评价结果报告》

6.《液体活检在临床肿瘤诊疗应用和医学检验实践中的专家共识 》

7.《液体活检技术在肺癌精准医疗中的应用》