膀胱癌液体活检的研究进展

DNA 生物标志物包括 DBC1、MYO3A、SOX11、NPTX2、NKX6-2、A2BP1、PENK 和 CA10 等，主要检测基因甲基化情况。

mＲNA 生物标志物包含微小 ＲNA-21( miＲNA-21)、存活素 mＲNA( survivin mＲNA) 、透明质酸酶 mＲNA 和尿路上皮特异蛋白mＲNA 等，主要检测含量变化。

蛋白质生物标志物包括细胞角蛋白( CK8、CK18、CK19、CK20) 、核基质蛋白( NMP 22) 、膀胱癌特异性核基质蛋白( BLCA-1、BLCA-4) 、细胞凋亡相关蛋白( Bax、BCL-2、Caspase-3、XIAP) 、基质金属蛋白( MMP-9、MMP-7) 、血管内皮生长因子( VEGF) 、组蛋白脱乙酰酶抑制剂M344、膀胱肿瘤细胞相关黏蛋白( LDQ10、19A211) 、白细胞介素( IL-1α、IL-6、IL-8) 、趋化因子、β-肌动蛋白( β-actin) 、上皮细胞粘附分子( EpCAM) 、纤连蛋白、甲基转移酶、端粒酶( telomerase) 、存活素( survivin) 和活素( livin) 等，主要检测含量变化及活性改变等情况。

其它生物标志物包括染色体9p21、血清素、褪黑激素、透明质酸( HA) 、纤维蛋白降解产物( FDP) 、色氨酸及其代谢产物等。

对不同标志物进行同时检测可以提高诊断准确性。同时，由于不同阶段肿瘤表达的标志物种类和含量不同，对不同的肿瘤标志物进行检测可以对肿瘤进行分期和分级，以便在不同的发展阶段采用不同的治疗手段，设计个性化的医疗方案。因此，不同的研究团队也基于不同种类的标志物开发出了多样的检测方法，其中主要包括UV-Vis 吸收光谱、荧光光谱、电化学发光、电化学传感、聚合酶链反应( PCＲ) 和凝胶电泳。

UV-Vis 吸收光谱是基于价电子的跃迁而产生对紫外可见波段的光吸收，根据光吸收程度可以对物质的组成、含量和结构进行分析、测定和推断。基于 UV-Vis 吸收光谱的膀胱癌生物标志物分析方法主要是与酶联免疫吸附试验( ELISA) 或夹心酶联免疫吸附试验等结合。生物标志物与酶标记的抗体特异性结合后，在特定的波长会产生光吸收，通过测试溶液吸光度变化来定量检测膀胱癌标志物浓度。该检测方法具有设备简单、操作快捷和快速检测等优点。然而，这种方法检测精度较低，虽然可以定性和半定量检测分析物浓度，但是难以实现膀胱癌标志物的精确定量。此外，这种方法在检测膀胱癌生物标志物方面还受限于灵敏度( 低于 60% ) 和特异性( 低于 80% ) 低的问题，因此膀胱癌诊断准确度较低。

基于荧光光谱检测膀胱癌生物标志物主要是利用荧光发光光谱，检测荧光染料标记的溶液发光强度或者样品的荧光成像，以此来定性或者定量检测生物标志物。基于荧光光谱的分析方法有 ELISA、荧光原位杂交( FISH) 和荧光成像等。荧光光谱主要是 2000 年之后发展的检测手段，至今仍有科研团队开发出基于荧光光谱的新型检测方法，并且此法也是医学上最常用的检测方法之一。

荧光光谱检测膀胱癌生物标志物具有操作简单、检出限低和重现性好的特点。然而，由于样品前处理无法纯净的提取待测标志物，造成检测过程中非特异性干扰较大，或者荧光成像背景荧光干扰较大，降低了荧光光谱的精确度。因此，需要开发可以屏蔽背景荧光和减少非特异性结合的探针等来克服以上问题。最近，长余辉发光材料得到了快速的发展，在激发停止后仍持续发出荧光，为膀胱癌细胞无背景荧光成像提供了一种可行性极强的策略。

电化学发光是利用电极原位产生试剂，这些试剂在溶液中反应，完成较高能量的电子转移而生成激发态分子，不稳定的激发态分子回到基态过程中以光辐射形式释放能量，检测其发光光谱和强度从而达到对物质进行痕量分析的目的。

基于电化学发光检测膀胱癌标志物的方法是近几年才发展的新兴手段。这种方法检测标志物的线性范围宽并且检出限极低，可至 10 pg /mL。然而，这种方法的材料价格较为昂贵，并且一般不可重复检测使用，所以还需要进一步探究可以重复使用且重现性好的电化学发光检测手段。

电化学传感主要是利用生物物质与待测物质接触时所产生的物理、化学变化，转化为电讯号输出以实现检测。膀胱癌标志物检测中主要是构建电化学免疫传感器，由分子识别系统和电化学转换器组合而成，分子识别系统是指固定的抗体或抗原，固定抗体或抗原在与对应的抗原或抗体结合时，电极的电化学性能会产生变化。

该检测手段主要是利用比表面积高、生物相容性好和电化学性能优异的材料做基底，在其上修饰抗体，免疫结合生物标志物后，电极的电学性能会产生微小变化，并且可以通过仪器精准地捕捉到该变化，以此来定量检测生物标志物浓度。这种方法是近几年新发展起来的，也是发展最为迅速、最为优异的一种检测手段，线性范围比电化学发光更宽，检测限更低，可低至 0. 33 pg /mL。但是同样存在材料较为昂贵，且多数为一次性检测器件的缺点，仍然需要进一步开发可循环使用且重现性良好的材料。

除了上述常用的几种检测手段，膀胱癌生物标志物还可以用一些包括凝胶电泳、亚硫酸氢焦磷酸测序、免疫印迹试验、拉曼光谱成像和核磁共振等检测方法来进行定性和定量的检测。

液体活检是一种具有非常好的发展前景的膀胱癌生物标志物检测方法。相比膀胱镜检查和组织活检的局部检测，液体活检是对尿液和血液的整体检测，反映了肿瘤细胞的整体表达情况。液体活检适用范围较广，可以对乳腺癌、结直肠癌、肺癌和胃癌等其它癌症进行诊断和监测。新一代测序技术和 ddPCＲ 技术的引入使循环肿瘤 DNA 检测技术得到了改进，降低了操作成本，节省了检测时间。

此外，与单一生物标志物检测相比，生物标志物组检测具有更高的灵敏度和特异性，从单一标志物到多标志物的转变将有助于推动该领域向前发展，结合基因组学、转录组学和蛋白质组学以适应不同水平的标志物检测也有助于提高诊断准确性。电学传感具有较高的精确度，较低的检出限和高的灵敏度，近几年迅速发展的石墨烯、碳纳米管和金属复合氧化物材料等具有低成本、优异电导性能和良好生物兼容性，易于制备成高灵敏的检测器件，加速膀胱癌数字化诊断的发展进程。

液体活检以其非侵入性、可频繁多次检测和快速检测等特点，在膀胱癌诊断中具有较好的发展潜力，但是还有许多生物、技术和临床方面的挑战需要解决。

在液体活检前期样品处理中，对尿液中沉淀物如蛋白质、ＲNA 和其它代谢物质的提取和分离还需要创新技术，以保证待测标志物不缺失和变质。循环肿瘤分子应该反映肿瘤的整体情况，但并不是所有的肿瘤位点均相同，难以确定癌症是来自原发性肿瘤还是转移性病变。

在膀胱癌早期，生物标志物( 如 CK8 /18 等) 表达量与正常人的表达水平相当，难以确诊是否患有膀胱癌。在膀胱癌生物标志物方面，目前还没有一种标志物的特异性和灵敏度能达到 100% ，因此液体活检目前还无法取代侵入性的膀胱镜检查。美国食品和药物管理局审核批准的膀胱癌生物标志物还需要进一步增多。

此外，液体活检仍然缺乏大规模的临床数据支持，目前没有清晰的临床共识。虽然液体活检还存在很多问题需要克服，在未来的医疗行业中，液体活检对肿瘤治疗疗效快速评价、肿瘤复发转移风险监测、高危人群早期筛查和辅助诊断、新肿瘤药物筛选、个体化治疗方案选择和肿瘤转移机制的研究等方面均有着巨大的应用前景。

参 考 文 献：

Ｒecent Advances of Liquid Biopsy for Bladder Cancer Diagnosing 应 用 化 学第 36 卷 第 4 期

DOI: 10． 11944 /j． issn． 1000-0518． 2019． 04． 180412