IVD细分领域的另一蓝海市场！无创产前检测的现状与前景

基于母体外周血胎儿游离DNA（cell-free fetal DNA，cffDNA）和高通量测序（Next-generation Sequencing，NGS）等技术的无创产前检测（Non-invasive prenatal testing，NIPT）正成为目前应用最为广泛的临床高通量基因检测技术应用。继1997年发现孕妇外周血中存在cffDNA后[1]，香港中文大学的卢煜明（Dennis YM LO）教授团队在2008年提出了应用NGS对cffDNA进行检测从而评估唐氏综合征风险的方法[2]，即NIPT。自此至今的十多年里，NIPT逐步得到了临床上的验证和技术上的发展。本文将从多个维度来介绍和剖析NIPT技术发展的现状，并思考和评估NIPT技术发展的前景。

本文将从三个角度剖析NIPT产业的发展方向，包括：（A）技术研发；（B）应用发展趋势；（C）临床科研合作。

NIPT的技术研发

NIPT的技术研发，首先要基于对应的技术平台。目前主流的NIPT是基于NGS技术的，主要分为illumina的基于可逆荧光终止子技术的测序平台以及thermofisher scientific的离子电压半导体技术的测序平台。前者的技术代表，在国内是以贝瑞和康的贝比安为主，国外有illumina的Verifi（收购自Verinata）[3]、natera的Panorama[4]和Sequenom（现Integratedgenetics）的MaterniT21 PLUS[5]；后者的技术代表，在国内是达安基因（达瑞健康）的无创产前检测、博奥检验的诺儿康[6]，国外有PremaItha的IONA[7]等。除此之外，华大的NIFTY[8]和NIFTY全因可基于多个NGS平台，包括基于原CG（Complete Genomics）的高通量三代测序平台，而国内还有天昊诊断的基于毛细管电泳的一代测序平台的NIPT技术，在国外有RocheqixiaAriosa为避免专利问题而重新研发的基于微阵列芯片技术进行DNA捕获的Harmony[9]。不同的技术平台，其NIPT的技术研发思路和发展前景是截然不同的。

基于NGS的NIPT技术研发

主流的基于NGS的NIPT技术研发，基本原理在于分析cffDNA的拷贝数变异（CNV）。最初Dennis LO团队在检测胎儿21号染色体三体时采用的是read count的CNV分析辅以Z-test作为显著性差异检验[2]，后续在13/18号染色体三体的研究中增加了对GC含量进行read count校正的方法[10]。这种Z-test属于baseline Z-test，即与阴性样本参考库的分布进行比较，这个阴性样本read count均值即为baseline value。实际上根据这个参考值的不同，可以有多种Z-test。华大的张秀清等人提出了以样本自身内部长度接近的染色体read count值作为参考值进行Z-test[11]，即internal chromosome。达瑞健康的NIPT则采用了以样本自身中值作为参考值，再与阴性样本参考库进行比较。上述3种Z-test都是常规的NIPT算法基础，目前市场上绝大多数的胎儿染色体非整倍体检测的NIPT产品都是在这个算法基础上进行完善。另一NIPT始创团队Stephen Quake在当时采用的是相关性分析和T检验[12]。

图1 基于read count的NGS NIPT的方法原理[2]

华大的NIFTY文章中，除了对阴性样本参考库的比较外，增加了对该样本可能存在的阳性情况的比较，即加入了对胎儿比例的考虑，并将两者的Z值相除得到L值，对L值进行T分布检验来判断结果[8]。这个考虑了胎儿比例和阳性情况的算法有助于提升NIPT的准确性。另外有欧洲的研究团队提出了对Z值再进行Z检验得到ZZ值，并同时采用Z值和ZZ值进行分类比较，来降低假阴性和假阳性[13]的发生。但这种方法在判定上过于累赘，而且受阴性样本库质量的影响。达安临检最近发表的文章中，提出了使用支持向量机（SVM）辅助NIPT判定的方法，通过对上述3种Z检验在阴性和阳性预测上的6种Z值结果，加上样本的临床指征作为机器学习的参数，训练出SVM模型来进行判定，有效提升准确率的同时降低约3%的灰区重测成本[14]。使用机器学习算法和人工智能深度分析，有望成为未来1-3年内提升NIPT准确性的发展方向。

对于基于read count的NGS NIPT技术，在实验环节上无论是illumina还是ion torrent平台，PCR扩增都是一个影响DNA真实拷贝数的环节。贝瑞及其合作者提出的环化单分子重测序技术cSMART[15]预期可消除这一环节引起的偏差，有助于在相对低的测序通量下获得稳定的真实信号。其实任何NGS技术的研发和应用，实验和计算都是紧密相关的。因此，不同的NIPT厂商必须要根据其NGS平台进行技术上的优化，这既可以是计算上的也可以是实验上的。

图2 基于size count 的NGS NIPT的方法原理[16]

Dennis LO团队在研究中发现游离的胎儿DNA长度比游离的母体DNA长度要显著短，因此通过对cfDNA的序列长度size进行统计，并与阴性样本参考库的对应值进行比较，即可进行染色体非整倍体的判定[17]。该团队后续还研发出相关的程序来进行计算[18]，并以此基础，开发出无需阴性样本参考库，即control-free的方法[16]。这种基于cfDNA size的NIPT，比较有效地降低了由于cffDNA的不足所造成的假阴性的问题。不过，cfDNA长度的计算依赖于测序方法本身：在illumina平台上，需要进行双端（Paired-end）的测序才能得到DNA片段长度的信息，而这个在一般NIPT产品如贝瑞的贝比安里是缺乏的；而在ion torrent平台，很神奇的是，尽管也是单端（Single-end）测序，但300个循环（flow）里总能满足cfDNA全长约150bp的测序，因此ion torrent平台能满足cfDNA长度需求的同时节省测序的成本和时间。目前基于size count的NGS NIPT技术研发好像只有Dennis LO团队在做，算法可被直接用于illumina平台的NIPT厂商的产品，然而ion torrent平台的NIPT产品应该同样可以适用。基于size count的NGS NIPT在计算量上比基于read count的NGS NIPT要少很多，对计算资源来说是一个优势，但准确性仍需进行大样本的分析。

其他NIPT技术研发

如果单单从检测21三体的角度出发，NIPT本身其实不需要用到NGS技术。Dennis LO团队最初也提出过使用数字PCR（Digital PCR）来进行21三体的检测[19, 20]。与数字PCR这种基于探针杂交的检测技术类似，微阵列芯片也是可用于NIPT的技术。Rocheqixia的Ariosa，最初也是使用illumina平台，并通过DANSR array的芯片技术来进行DNA捕获和建库[9, 21]，缩减测序通量和提升信号的稳定性。受困于NIPT方法专利上的问题，后来Ariosa直接使用微阵列芯片来进行NIPT检测，并指出芯片NIPT比基于NGS的NIPT有更高的稳定性[22]。

基于探针杂交技术的NIPT在计算上的资源消耗远低于NGS NIPT，这是因为NGS NIPT需要对高通量测序数据进行比对分析，不光数据量巨大（GB级别）而且计算量也不是普通PC可以承受，但一般这个比对分析的计算资源可由测序仪厂商提供配套的服务器来解决。而数字PCR或芯片NIPT能得到反映DNA相对定量的荧光值，可直接用于拷贝数分析，算法上类似基于read count的NGS NIPT。尽管在计算上拥有资源消耗低的优势，但随着NIPT性能逐渐强大，芯片NIPT在性能拓展上可能存在成本上的劣势。目前Ariosa的Harmony可以检测3种三体、性染色体非整倍体以及22q11.2微缺失，暂时未知后续功能增加的研究方向。自NGS技术开发以来，高通量测序的成本日益下降，但芯片方面的成本却下降缓慢。虽然NGS方面在建库的成本上一时间很难大幅降低，但在测序环节上成本是逐年下降，换而言之，同样的测序成本在未来可以承担更高通量的测序，为NGS NIPT提供更好的性能；而基于芯片的NIPT，在拓展性能的技术研发上可能需要成倍的增加成本（探针数的增加和微阵列的重新设计），成本的维持或降低需依赖于芯片技术的更新换代。

基于一代测序的NIPT属于小众的技术，国内目前已知是天昊诊断（genesky）在做，但暂时应该还没有CFDA认证的仪器和体外诊断试剂，因此即使有NIPT产品也只能发科研报告。天昊这款基于毛细管电泳测序技术的NIPT产品叫NiPS，通过对多个特定位点设计扩增（Multiplex amplification）和测序引物，并从一代测