快速、准确、经济：CRISPR技术在疾病检测中的崛起

基因编辑编年史从30年前开始，第一次基因编辑是在酵母细胞实验中完成。但是直到过去五年，CRISPR Cas9系统出现并且迅速成为目前最受欢迎的基因编辑手段，被《科学》杂志评选为2015年度的突破技术。

近日，Nature新闻版块报道了基于基因编辑技术开发了可用于拉沙热等疾病早期诊断的方法，这有助于控制这些烈性传染病的传播。

拉沙热(Lassa fever)是在尼日利亚、几内亚、利比里亚和塞拉利昂等西非地区流行的一种人畜共患疾病，是由拉沙热病毒（沙状病毒科，单链RNA病毒）引起的，感染后病程1-4周；该病毒因其治疗难度和传染性被评为危险等级最高的病毒（生物安全第四级：给人类造成致命的疾病，并且在绝大多数的情况下是不可救治的，最著名、危害最大的病毒要数埃博拉病毒Ebola和拉沙病毒Lassa）。

快速、准确且经济是对理想诊断方式的基本要求，此外还应该兼顾操作的简便性（操作不需要专业人员、简单培训即可）、尽量避免专业设备和过强的基础设施要求（如电力条件等）。因为埃博拉病毒（Ebola virus）、拉沙病毒（Lassa virus）等疫情常常在偏远地区爆发，如果有理想的诊断技术，便可尽早发现患者，然后将其隔离治疗，避免疫情的扩散。因此，快速、准确地诊断传染性疾病是防控重大疫情传播的关键。

CRISPR分子诊断技术的开发

2018年2月15日的《Science》上发表的两项研究分别展示了由 Jennifer Doudna 和张锋实验室基于 CRISPR 系统开发的全新诊断工具。

在其中一篇论文中，Doudna的团队展现了一个名为DETECTR的系统，它可以准确地识别人源样本中不同类型的 HPV 病毒。在另一篇论文中，张锋团队则展示了性能优化的 SHERLOCK 系统，该系统于去年开发成功，用于检测人源样本中的寨卡病毒，登革热病毒以及其他有害细菌。 

这两篇论文共同证明了 CRISPR 的巨大潜力，而不仅仅只用于基因组编辑。

“它使新一代诊断技术成为可能，并且比目前的技术更具成本效益” ，罗切斯特大学生物化学和生物物理系的助理教授 Mitchell O'Connell 说。 

Doudna 团队：100%准确检测出 HPV 16 感染

在《Science》发表的研究中，Doudna 团队使用的是 CRISPR-Cas12a 系统。他们发现一个很有趣的现象：这种 CRISPR 系统在剪切靶向的双链 DNA 的同时，Cas12 的 DNA 酶活性会被激活，而该酶能非特异性切割单链 DNA（ssDNA）。

该研究的共同作者，加州大学伯克利分校实验室研究员 Janice Chen 对此表示：“这是一个意外但是很‘疯狂’的发现。”

图丨 DETECTR 工作原理

之所以说这是一个“疯狂”的发现，是因为这个发现为细胞内检测是否含有某目的DNA 提供了一个全新的思路：同时向细胞内递送靶向该 DNA 的 CRISPR-Cas12a 系统和非特异性 ssDNA 荧光报告基因（FQ-labeled reporter），一旦检测到目的 DNA，CRISPR-Cas12a 系统将启动，与此同时，荧光报告基因也会被降解，从而释放出荧光信号。

基于此，Chen和她的同事们开发了一种可用于诊断病毒感染的新型诊断工具，并通过与等温核酸扩增技术的联用提高了灵敏度。该工具被命名为DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter，简称 DETECTR。

到目前为止，科学家们已在试管水平证明 DETECTR 可以100%准确地检测出HPV16感染，92％准确地检测出 HPV18 感染。HPV16 和 HPV18 能增加患者发生癌症的概率，是两种特别危险的HPV 亚型。

“当然，我们还需要不断改进该系统。但从原则上来说，这个想法是可行的，我们真的很兴奋。”Chen说。

令人欣喜的是，相比于其他测试，DETECTR测试价格低廉且快捷：单次成本不到一美元，只需一个小时。

现在，Chen和她的团队正在努力开发能轻松读取荧光信号的硬件设备。他们还想测试系统是否能响应其他人源样本，如血液，唾液或尿液。

张锋团队：灵敏度提高100倍，可检测多种病毒

去年，张锋团队向公众展示了 SHERLOCK 如何利用 CRISPR-Cas13a 在多种人类样本（如唾液）中发现寨卡，登革热的 RNA 序列，甚至一些与癌症突变相关的序列。

而今，SHERLOCKv2 诞生了。与 SHERLOCK 相比，其灵敏度提高了100倍，并能在同一样品中检测出多种病毒感染，比如能同时检出寨卡 和登革热病毒。

之所以能达到这样效果，是因为他们在 SHERLOCKv2 中引入了多种来自不同种属细菌的 Cas13 酶，如 LwaCas13a 和 PsmCas13b。

图丨 CRISPR-Cas13a 

这些不同的 Cas 酶对不同的RNA序列表现出不同的“偏爱”程度。换句话说，同时向细胞递送多种酶和多种不同荧光的报告基因，一旦 CRISPR 系统发现目的基因，对应的Cas13就会启动剪切酶活性，剪切相应的荧光报告基因，从而释放出荧光信号。

这原理其实和 Doudna团队的 DETECTR 基本一致，只不过张锋团队设计的荧光报告基因必须是特异性，而 Doudna 团队则是非特异性的。然而，也正是“特异性”这个优点使得 SHERLOCKv2 可以同时检测多种序列。

同样相似的思路是，为了提高灵敏度，张锋团队也引入了等温核扩增技术。但是除此之外，他们向体系中还引入了CRISPR type-III中的Csm6酶。Csm6酶的特异性切割序列为环腺苷酸分子和末端为2’,3’-环磷酸的线性腺苷酸。他们发现通过设计CRISPR系统使得Cas13剪切后的序列是Csm6酶的靶向序列，能大大提高灵敏度。

“这些放入一个管中的所有酶，它们不仅相互作用发挥了更好的作用，而且让我们得到了珍贵的生物学信息。这真是太棒了，充分向我们展现了生物化学的强大力量”，论文的共同作者，来自张锋实验室的博士生 Jonathan Gootenberg说。

目前，病毒感染诊断一般包括病毒分离与鉴定、病毒核酸与抗原的直接检出以及特异性抗体的检测，不仅耗时长，而且对医疗设备和操作人员的专业水准要求很高。因此，如果能开发出一种不需依赖贵重设备和医护人员的智能诊断设备显得非常重要，尤其对于病毒感染经常肆意横行的发展中国家。

而与 DETECTR 相比，张锋团队论文所描述的诊断工具SHERLOCKv2离这样的目标更进一步。

图 | SHERLOCK 试纸检测结果展示

像 DETECTR 一样， SHERLOCK 也使用荧光信号作为输出。但是不仅仅限于此，张锋团队还开发了类似于验孕棒一样的试纸检测方法。现在，不需要任何特殊设备，只需一张试纸，SHERLOCKv2 就能显示出病毒感染检测结果，非常易于使用。

“试想一个很糟糕的情况，没有任何能源如电力。然而只要有样品，SHERLOCKv2 试纸就能在现场发挥作用”，O'Connell 称。而且它也很便宜：SHERLOCKv2 试纸只需几美元。

虽然 DETECTR 和 SHERLOCK 已向我们展现出它们在诊断中的强大力量，但是在进入临床使用前，研究者们仍有很多工作需要做以确保诊断的准确性。

不过，相信这些新诊断工具绝对将改写未来的诊断技术，尤其将给那些缺乏先进设备和训练有素的人员的发展中国家带来很大不同。“它有影响人类健康和全社会的真正潜力”，来自张锋实验室的另一位博士生、该论文的共同作者Omar Abudayyeh说。

总而言之，两支团队正在开发的这些基于CRISPR、用于快速诊断感染的便宜设备，有望为全球，特别是发展中国家的病毒（如 HPV 和寨卡）感染诊断，带来一场真正的革命。

 图5 尼日利亚研究人员正在使用CRISPR分子诊断试剂检测血液样本中是否含有拉沙病毒

尼日利亚的分子生物学家Jessica Uwanibe说，可靠、易用的拉沙病毒检测技术能减少高达60%拉沙热患者的死亡，这是一项可以挽救很多人性命的事业。

洪都拉斯和美国加州的科学家正在用CRISPR介导的分子诊断技术测试登革热病毒（dengue viruses）、寨卡病毒（Zika viruses）和人类乳头瘤病毒（HPV）的检出效率；而在刚果民主共和国CRISPR分子诊断技术被用于埃博拉病毒（Ebola virus）的检测。

不可忽视的市场力量

世界卫生组织驻尼日利亚技术官员Dhamari Naidoo说：“这些事非常令人兴奋的创新，” 但她补充道，如果想让CRISPR分子诊断技术在低收入国家中产生足够的影响，研究人员必须确保该技术的授权、制造和价格等这些国家能负担得起。

Naidoo说，研究人员常常忽视那些因素，比如各国研究人员大约开发了12种埃博拉病毒（Ebola）的诊断试剂，但只有2种试剂能在刚果（金）埃博拉疫情爆发后应用。其余的均因经济原因受阻，如试剂的市场容量不足抵消制造和分销这些产品的成本。

由于伯克利和Broad之间仍存在专利之争，从经济角度来看基于CRISPR的分子诊断技术可能尤其麻烦。但Doudna和Pardis Sabeti（SHERLOCK项目负责人之一）两个团队均表示她们正致力于授权这些工具，以确保需要这些分子诊断工具的人们能够使用。

对Uwanibe来说这一天来得还不够快，她说“这一天我希望我们能更尽早的实现。”