均相光激化学发光免疫分析技术

均相光激化学发光免疫分析技术(amplified luminescent proximity homogeneous assay linked immunosorbent assay,AlphaLISA) 是一种以表面包被有亲和涂层的受体微球(acceptor beads) 和供体微球(donor beads) 为载体的均相免疫学检测技术。该技术灵敏度高、特异性强、背景影响低、样品要求低、耗费少、分析操作简单以及检测范围宽泛，既适用于传统ELISA 和其他化学发光技术可以检测的小分子简单相互作用，更可以胜任大分子复杂相互作用的高通量检测。

均相光激化学发光免疫分析技术(amplified luminescent proximity homogeneous assay linked immunosorbentassay, AlphaLISA) 是以生物分子间相互作用为原理，荧光共振能量转移发光为基础，以硅胶微球为载体，时间分辨荧光为检测模式的免疫学研究技术。该技术起源于1994 年研究发现的单线态氧分子能量传递发光原理，并据此建立的光激化学发光技术(light initiated chemiluminescent assay,LICA)，光敏剂经激发光照射产生单线态氧，发光剂接受单线态氧能量传递产生荧光。1999 年，这一技术经Perkin Elmer 公司改进，将光敏剂、发光剂包被于涂布有亲和涂层的硅胶微球表面，以此种微球作为免疫吸附的载体进行免疫学分析，从而诞生了AlphaLISA 技术。该技术以免洗涤、易于自动化和机械化的操作优势，以高灵敏度特异性和高通量的技术特点，成为近几年免疫研究分析的热点，已广泛应用于生物医学研究，代表了现在及未来分析检测技术的发展趋势。

1 AlphaLISA技术原理

AlphaLISA主要利用分子间相互作用原理，如抗原抗体特异性相互作用，以硅胶微球为载体，当分子间存在相互作用而使得微球相互接近时，通过激发光激发，产生荧光检测分子间相互作用。该技术采用表面化学处理硅胶微球，供体微球和受体微球表面包被有亲和涂层，常见的如亲和素、链亲和素、ProteinA、ProteinG 等，可以结合待测生物分子，分子间相互作用会将供体和受体微球拉近至单线态氧扩散范围以内，即200 nm 以内，从而激发级联放大的化学发光反应。其发光原理为光激化学发光，供体微球表面涂布光敏剂苯二甲蓝，受体微球表面涂布发光剂二甲噻吩衍生物并螯合有稀土原子铕。因而，当用680 nm 的激光照射时，供体微球表面光敏剂分解环境中的氧，形成单体氧分子( 氧自由基)，单体氧分子扩散到受体微球，将能量最终传递给稀土原子铕，激发波长为615 nm、半衰期为0.3 s的激发光，可以采用荧光扫描仪检测( 图1)。

2 AlphaLISA技术特点

AlphaLISA具有高通量、分析操作简便、稳定性强、背景影响低、对样品要求低、样品消耗少、灵敏度特异性高和检测范围宽泛等特点，是进行科学研究通用平台建设的良好选择。

2.1　高通量、节约样品、操作简便

AlphaLISA微球足够小，直径为188 nm，实验时经混匀不会自然沉淀或堵塞移液头，使自动化液体处理非常容易，适合进行高通量仪器扫描检测实验；同时，微球也足够大，有足够的沉降系数，因此，整个偶联过程不需亲和柱纯化，只需要离心就可将偶联蛋白和未偶联蛋白分离。整个AlphaLISA 检测过程可控制在2 h 以内，而ELISA普遍需要至少4 h，其简单的操作适合机械自动化操作。目前，结合配套耗材有96 孔、384 孔、1 536孔及3 456 孔方式的检测，灵敏度不受影响，并且不需调整试剂浓度。检测体积为50 μL，根据实验需要可减少到10 μL、5 μL，乃至2 μL，达到节约成本的目的，微量检测非常适用于大量样品高通量检测，适合稀有样品检测。Foo 等利用AlphaLISA 技术检测唾液中NT-ProBNP 含量，仅耗费了1 μL 唾液，相当于ELISA 五分之一的样品，灵敏度可达到16 pg/mL，为ELISA 检测的15 倍，总检测时间仅1.5 h。Liu 等建立了AlphaLISA 检测乙肝表面抗原技术，灵敏度0.01 IU /mL，线性范围0.04 IU/mL 至 100 IU/mL，总耗时仅0.5 h。Dynon等采用此技术检测孕中早期(13~14 周) 血清先兆子痫标记物HtrA3 浓度，可在1.5 h 内快速区分健康和高危人群，帮助临床及时采取治疗措施。Edwards 等改进组蛋白H3 (1~21 残基) 甲基化检测方法，采用AlphaLISA 技术代替原有均相时间分辨荧光技术(HTRF)，样品消耗从10 μL 减少到1 μL，同时减少了耗材和样品的耗费，将检测成本从8 000$/10 000 孔降低到600$/10 000 孔。AlphaLISA各组分经过孵育后无需洗涤、显色等步骤，可直接扫描检测，优化后的AlphaLISA 检测系统可以极大程度地节约时间和人工，适用于临床高通量检测筛选。

2.2稳定性强

AlphaLISA检测体系具有良好的稳定性，由于其接近发光效应取决于单分子氧能量传递，而光敏剂和发光剂并不产生损耗，在一定时间内可重复检测，结果稳定。Zhang 等研究人体唾液纤溶酶原激活物抑制剂1 (PAI-1) 的浓度，分别于上午9 点，下午16 点采集唾液和血液进行检测，实验批间变异系数8.59%，批内变异系数7.52%，皆符合统计学标准，唾液PAI-1 的中位数浓度在上午为394μg/mL (243.4~833.1 μg/mL)，下午为376 pg/mL (129.1~615.4 pg/mL)，血浆浓度为59 000 pg/mL (24 000~110 000 pg/mL)。唾液PAI-1 浓度与血浆不相关(P =0.812)。研究人员试验将研发的乙肝表面抗原AlphaLISA 检测试剂盒放置4°C 半年或37°C 7 天，试剂盒检测信号变化不大，标准曲线稳定，标准品质控点信号无明显升高。Dudal 等对现有免疫学研究手段检测性能的研究表明，AlphaLISA体系稳定性更强，检测系统标准曲线稳定达一年以上。这一特性使得AlphaLISA 技术方便体系优化、条件优化或改变反应配对进行优化，检测平台建立后可长期使用，而解离增强镧系元素荧光免疫检测(DELFIA) 每6 个月至一年需要对检测试剂进行重新评估。

2.3背景影响低、样品要求低

本技术接受680 nm 激发光，发射615 nm 发射光，激发光与发射光波长差异大，因此背景荧光影响很小。615 nm 的发射光波长与血清及组织提取液等样本中其他物质的发射峰均不相同，因此避免了如血红蛋白、胆红素等杂质对检测信号的干扰，并最大程度降低了检测信号的背景值，因此对样品要求低；而供体微球表面的高密度光敏剂，可使每个微珠每秒产生上万个单线态氧( 氧自由基)，级联放大信号值，从而使检测灵敏度达到埃摩级水平；AlphaLISA 采用特定的680 nm 激发光激发级联放大化学发光反应，该反应的半衰期为0.3 秒，可使用时间分辨的方法检测。时间分辨荧光模式，即同时检测荧光信号值和时间两种数据，由于稀土原子铕激发光半衰期长达0.3 秒，远长于血红蛋白等干扰物质的发光时间，因此延迟检测可有效规避背景荧光，进一步降低了背景，提高了扫描信号的信噪比，确保了结果的真实性，是进行复杂样品检测的理想选择，如血清和血浆、全细胞裂解物、唾液和组织提取物等。此技术降低背景影响的同时提高了灵敏度和线性范围，同时对样品要求低，可直接检测体液中的生物分子，只用很少的样品即可得到精确结果，因此可进行稀有样品的检测。

2.4 灵敏度高、检测范围宽泛

AlphaLISA的灵敏度可达亚摩尔(10⁻¹⁷) 水平。激发光照射时，每个供体微球每秒钟可以产生60 000 个单体氧，单个受体微球可结合200~300 个抗体，基于微球的均相反应体系提高了反应比表面积，大幅度增强了反应灵敏度，在有些生物分析中甚至可以检测低至10−18 mol 的样品。由于背景低、抗淬灭能力强，AlphaLISA 技术具有非常宽泛的线性范围，可以检测亲和力从“sub-nmol/L”(10−18)到μmol/L 级范围内的相互作用。

单分子氧的半衰期为4 微秒，扩散距离为200nm。Alpha 供体微球和受体微球在小于200 nm 的范围内都可被检测到，因此，不光可以检测常规的小分子相互作用，如抗原抗体、配体、第二信使、细胞因子与受体间相互作用，更可以检测完整蛋白质、酶复合体、噬菌体等相对分子质量巨大或非常复杂的复合物和相互作用。由于溶液中分子间远大于此距离，在生物分子不存在特异的互相作用时，单体氧无法扩散到受体微球，则不会有信号的产生。也正是这200 nm 的单体氧扩散距离，使得AlphaLISA技术得以检测更复杂的相互作用，也可比较检测分子量相差悬殊的配体。而其他均相技术，例如时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)、荧光偏振(FP)，供体和受体之间的距离为10 nm，仅限于小分子的检测。常慧等建立了大鼠血清仙台病毒Alpha快速检测平台，与ELISA 试剂盒比较对40 例随机大鼠样品的检测，检出阳性率达20%，高于ELISA的17.5% 的检出率，经IFA 验证Alpha 平台检测结果为真阳性。

Chen 等开发了针对特定细胞表面抗原的免疫细胞筛选滤膜，在受体微球上结合特异抗体，AlphaLISA 能快速、灵敏地直接检测从微量的血液样本中分离的CD14+ 细胞，每分钟可以分离20 ml血液样本，高达70% 的捕获率和97% 的准确率。Szekeres 等分别于细胞裂解物和组织裂解物中比较使用AlphaLISA 技术、均相时间分辨荧光(HTRF)技术和ELISA 检测老年痴呆( 阿尔茨海默症) 的生物标志物Aβ1-40 和Aβ1-42 的含量，结果显示ELISA检出限为125 pg/mL，HTRF 约为22 pg/mL，而AlphaLISA 可检出低于2 pg/mL 水平的待测物质，最为灵敏。Tian 等用AlphaLISA 检测人血清HBsAg水平，其最低有效检测浓度为0.01 U/mL，线性范围0.04~100 U/mL。TR-FRET ( 时间分辨免疫荧光) 和AlphaLISA 都是灵敏、特异、高效的均相时间分辨荧光检测手段，而TR-FRET 对样品要求较高，检测线性范围也不及AlphaLISA 宽泛。贺安比较酶联免疫分析(ELISA)、化学发光免疫分析(CLIA)、电化学发光免疫分析(ECLIA) 和时间分辨荧光免疫分析(TRFIA) 与其实验室开发的AlphaLISA 技术对癌胚抗原检测性能，其中AlphaLISA 检测下限可达到0.11 ng/mL，高于商品化的ELISA、CLIA、ECLIA数个数量级，检测范围宽泛(0~600 ng)。虽然TRFIA在灵敏度上与AlphaLISA 相似，但样本消耗量多10 倍。除AlphaLISA 外，其他检测方法皆需要洗涤步骤来除去未结合的分子。Qian 等比较AlphaLISA、DELFIA、LanthaScreen 对细胞的组蛋白H3 的Lys27 三甲基化(H3K27me3) 检测性能，其中AlphaLISA 在2 500 个细胞水平可检出明显差异，经Western 验证无假阳性结果，LanthaScreen与DELFIA 在5 000~20 000 个细胞水平检测出甲基化差异，样品耗费大于Alpha 技术。AlphaLISA 检测样本范围更宽，达到3~5 个数量级，样本消耗更少，因此也更为经济。

AlphaLISA技术结合了表面化学、免疫学、激光技术、氧自由基能量传递、均相反应技术等优点，相较其他免疫分析技术有突出的优势( 表1)。

3AlphaLISA在生物学、生物医学检测中的应用进展

AlphaLISA已经被成功地应用于酶功能检测，生物分子包括受体与配体、蛋白质与蛋白质、蛋白质与核酸等的相互作用检测，免疫检测和G 蛋白偶联受体功能检测(cAMP，IP3) 等热点领域。受体微球可以与一抗偶联，也可以利用物种特异性的二抗偶联的受体微球或ProteinA ( 重组纯化蛋白A)、ProteinG ( 重组纯化蛋白G) 和抗融合蛋白偶联的受体微球。受体微球也可以与特定的结合蛋白偶联，在生物医学领域有着广泛的应用现状和前景。反转录病毒激活蛋白(Tat) 在人类免疫缺陷型病毒1 (HIV-1) 的复制中起重要作用。它募集宿主转录延伸因子(pTEFb) 与RNA 聚合酶II，使得HIV-1 病毒RNA 复制延伸。阻断Tat 和pTEFb 相互作用为抗病毒治疗提供了新思路。Burlein 等使用His标记pTEFb和生物素化的Tat，利用AlphaLISA监测Tat 和pTEFb 之间的相互作用，采用竞争法测定了未标记的pTEFb。该测定的Z 值大于0.5，说明AlphaLISA 是简单快速、强劲的高通量筛查手段。该测定的发展可以促进一类新的抗病毒剂HIV-1 的发现，为患者提供更宽泛的治疗选择。Tian 等建立AlphaLISA 检测平台研究乙肝表面抗原，利用单克隆抗体筛选乙肝抗原主要亚型(ADR 和AY) 以确认平台对于突变体的敏感性。检测线性范围在0.04~100 U/mL，检测最低限可达0.01 U/mL，与ELISA 以及商品化学发光试剂盒相比，结果相关系数为0.91，且更为敏感且快速，是乙肝表面抗原检测的理想体系。林冠峰等利用光激化学发光免疫分析法建立人促卵泡激素hFSH 的快速检测平台，分析敏感性和功能敏感性分别为0.09 和0.12 U/L，线性测量范围为0.09~192 U/L，试剂的分析内变异系数(CV) 和分析间CV 分别为4.2%~7.1% 和7.5%~8.3%，均<10% ；检测100 份临床血清样本，本试剂检测结果与商用化学发光试剂盒检测结果相关系数为0.979。Poulsen 等用ELISA 和AlphaLISA比较检测人血清中胰岛素水平，证实AlphaLISA 技术具有明显高的灵敏度，对血清的需求量只有ELISA的五分之一，灵敏度却是后者的15 倍。

AlphaLISA技术显示了高灵敏度和适应复杂样品的优异特性。乳糜泻患者可根据血清标志物脱酰胺醇溶蛋白肽(DGP) 诊断，重组全人源化单克隆抗体(hmAb) 是由分离自患者的浆细胞分泌的抗麦胶蛋白IgA 抗体。Steinsb 等利用重组人抗麦胶蛋白多肽单克隆抗体hmAb 1002-1E03 对患者和健康人群血清DGP 进行抑制性实验，检测患者和对照组血清DGP 抗体水平，选用的检测抗原是ω- 醇溶蛋白和低相对分子质量谷蛋白中分离的34aa 和26aa 的肽段。此AlphaLISA 检测系统具有86.8%的灵敏度和98.6% 的特异性，优于常规的商品化试剂盒且方便快捷，已成为临床诊断的重要参考检测。人血液中20% 的蛋白质成分可在唾液中找到，唾液作为诊断样本，有非入侵性、简便安全的特点。Foo 等利用双抗夹心法AlphaLISA 技术检测健康人群(40 例) 及心衰患者(45 例) 唾液NT-proBNP水平，并分析其与血液NT-proBNP 的相关性，结果显示唾液的NT-proBNP 水平在健康人和心衰患者间存在明显差异，中位数分别为16 pg/mL 和76.8 pg/mL。免疫测定显示82.2% 的临床灵敏度和100% 的特异性，100% 阳性预测值和83.3% 的阴性预测值，以及90.6% 的总诊断的准确性。唾液与血液样品检测相关性R2 = 0.78 (p = 0.01，y=1.7056 + 1910.8)。Zhang 等研究唾液中心血管疾病指示物纤溶酶原激活物抑制剂-1 (PAI-1) 水平，早晨和晚上唾液纤溶酶原激活物抑制剂-1 (PAI-1) 中位数分别为394pg 和378 pg，证明唾液取样时间不影响检测结果，而血液中此蛋白含量早晚有明显差异。

肿瘤标志物是肿瘤诊断，尤其是早期诊断的重要检测指标，AlphaLISA 技术因其灵敏、快速、高通量的特点，促进了肿瘤标志物检测的发展。cyfra21-1 是细胞角蛋白19 的可溶性片段，目前主要用作肿瘤标志物，对肺癌的诊断有较大意义。He等建立检测血清cyfra21-1 水平的AlphaLISA 平台，灵敏度达0.08 ng/ml，检测范围涵盖0.08~500ng/ml，与商用ECLIA 法检测相关系数达0.97 以上，且无需洗涤。 Yakubov 等建立AlphaLISA 研究平台，研究His 标签的TG2 与生物素化FN 片段相互作用( 两者分别通过标签结合于受体微球和供体微球)，期待找到影响这一复合体结合的小分子。经过对10 000 种小分子化合物的筛选，从中选择对TG2-HF 复合体有70% 以上抑制作用的小分子。后续测定其对卵巢癌细胞黏附、迁移和增殖能力的影响，最终筛选出TG53 作为TG2-HF 复合体形成的抑制剂，并进行后续研究。添加10 μmol/L 的TG53可以显著抑制细胞划痕修复，TG53 有望成为卵巢癌种植性转移(transcoelomic metastasis) 的抑制剂。Leister 等联用AlphaLISA和HTRF 技术，分析了THP-1 细胞中各种潜在配体和TNFα 的相互作用，在1 280 种小分子化合物中发现了几种新的TNFα抑制剂，其中AlphaLISA 采用1536 孔板，样品消耗量小，检测下限(LDL) 为3.6 pg/mL，动态范围为3.6~30 000 pg/mL，比起传统的ELISA 在灵敏度和数据通量方面有明显优势。HuR 在多种类型的癌症中呈高丰度表达，通过与癌症相关mRNA 相互作用，促进癌基因表达。Wu 等[26] 从6 000 个小分子抑制剂中，用AlphaLISA 技术筛选出对HuR 与mRNA 相互作用抑制效果最高的HuR-ARE，为HuR 高表达型癌症的靶向治疗提供了新途径。

AlphaLISA技术平台可与其他技术平台结合使用，提高研究或诊断性能。Schneider 等结合AlphaLISA 与串联泛素结合实体(TUBEs) 分析技术研究Mdm2 活性，该技术可用于寻找潜在的Mdm2抑制剂。此技术平台可应用到Hrd1、TRAF6 和Smurf1 E3 连接酶的活力测定，因此有普遍适用于其他E3 连接酶的潜力。Zeta 等并联AlphaLISA技术与高度集成微流体技术，检测血清样本中TNFα 水平，与现成的ELISA 检测平台比较，灵敏度提高到10 pg/mL，时间缩短至45 分钟内，同时检测8 个样品，建立了快速、自动、平行定量免疫学研究平台。

AlphaLISA检测技术具有高度的敏感性、均一性和宽泛的检测范围，操作简便，样本需求量低，减少了总检测时间的同时提高了检测的效率。同时，它有效回避了样品荧光干扰，对待测样本质量需求低，易于优化检测体系，真正实现了检测的均一性。未来随着工艺的改进，成本将不断降低，且此技术的高通量特性使得大规模样本检测中，单一样品检测成本得以压缩。疾病的生物标记物，尤其是肿瘤标记物的研究发展需要高灵敏度、高通量、易于自动化的检测平台，有利于在疾病初期及时诊断并实施干预。和许多新技术一样， AlphaLISA 检测还存在试剂、仪器成本较高的问题，需要技术突破来解决；其研究和应用还不够成熟，目前针对临床常用检测指标分子的AlphaLISA 检测试剂盒还很少。但近年来越来越多的研究成果表明，AlphaLISA 检测技术平台必将成为基础医学研究、疾病诊断、转化医学等多领域研究的得力手段。

参考文献

Life Sciences