肿瘤研究依赖于模型系统，其在一定程度上反映了肿瘤的生物学特性。人类肿瘤的重要特征是肿瘤内的基因组异质性和不稳定性。然而基因组不稳定性的程度在肿瘤模型中却很少被关注。 近年来，随着肿瘤模型研究的不断深入，肿瘤模型研究极大地扩展了其在肿瘤精准医学中的应用。 一是通过建立肿瘤模型的大队列 ( 生物信息库 ) ，并对这些模型进行广泛的基因组和表型表征，来揭示患者群体水平的基因型和表型之间的关联。 二是通过建立患者衍生的肿瘤模型，其越来越多的被用在其原发肿瘤模型上，试图预测患者特异性药物反应。 而对于这两种应用，肿瘤模型不仅需要透切了解肿瘤的来源，还需要稳定、准确、可靠的表现其在扩增过程中的基因组和表型特征。然而，由于肿瘤模型的进化，肿瘤研究产生了一个亟待解决的问题——“可重复性危机”，即无法重复文献报道的研究结果。 目前只有11-25%的研究结果可以被工业化实验室重复出来。不仅如此，大规模的肿瘤细胞系中的药物筛选结果之间也经常出现差异。
近日，Nature Cancer Review 在线发文：Genomic evolution of cancer models: perils and opportunities。在这篇综述中，作者总结了肿瘤模型中基因组进化的新证据、生物学起源及功能结果；强调了肿瘤模型进化对肿瘤基础研究 ( 尤其是精准医学 ) 和临床应用的影响；并提出了可以降低基因组进化风险的的方法。 一、肿瘤模型中基因组进化 对人类肿瘤细胞的任何功能检测都必须依赖于患者来源的肿瘤模型，如源自患者的细胞株 ( patient-derived cell lines , PDCLs )，源自患者的类器官 ( patient-derived organoids , PDOs)以及源自患者的异种移植物 ( patient-derived xenografts , PDXs ) 。 要获得这些模型，需要肿瘤细胞快速适应新环境。由于不同的选择压力，再加上肿瘤细胞通常缺乏有效维护基因组完整性的能力，其固有的基因组的不稳定性使它们在增殖过程中极易发生基因改变或基因损伤，肿瘤模型中出现了那些最适合并增殖最快的癌细胞，且不断发生改变。这就是所谓的“肿瘤模型基因组的evolution” ，在这里“evolution”是 “演变” 更是 “进化” 。 因为即使在肿瘤模型中，也证明了达尔文的进化论。 即使是非患者来源的肿瘤模型，如基因工程小鼠模型(GEMMs)，也同样会经历肿瘤水平和宿主水平的基因组进化。因此，肿瘤模型的进化正逐渐成为肿瘤建模的一个重要方面。
（一）ECLs 已建立的细胞系 ( ECL ) 在培养中的会出现多样化，这在十多年前就发现了，并且一些最常用的癌细胞系，如宫颈癌细胞系HeLa和乳腺癌细胞系MCF7，就是因为其经常变异而臭名昭著。最近的研究表明，对独立培养在2个实验室 ( 美国和英国 ) 的超过100个ECLs进行比较发现，在2个比较的细胞株里中有1个被检测到突变的可能性就有20％。基因表达的变异反映了遗传变异，并且特定的遗传改变通常与遗传扰动途径的转录特征相关。 （二）PDCL 源自患者的原代细胞株 ( PDCL ) 在很大程度上保留了原发性肿瘤的基因组特征，但是在连续传代过程中还是会出现拷贝数变异 ( CNA ) 。研究表明，在整个传代过程中，约有20%的基因组在早期 ( <p5 ) 和晚期传代 ( >p10 ) 中受到拷贝数变异的影响，并且早期CNA进化的更快。这表明模型的建立与基因组进化相关，并且模型最终在适应新环境后变得更加稳定。 （三）PDX 对24种癌症类型的543种异种移植物 ( PDX ) 模型中的CNA进行了分析，发现约60％的PDX模型在一次传代中获得至少1次大染色体畸变，并且约90％在4次传代中获得至少1次这样的畸变。与PDCL中的观察相似，基因组进化在PDX起始和早期传代期间最快，并且其速率在后期第81代显着降低，与强烈的选择压力与模型启动相关。另外，PDX在整个传播过程中也易受表观基因组进化的影响。
（四）PDO 作为新一代肿瘤模型，患者来源的类器官 ( PDO ) 更好地保留了肿瘤基因组特征，因为类器官可以更好的囊括原始肿瘤组织，而且可以减轻体外转变的一些选择压力，所以PDO往往比PDCL 效果更好。 研究发现PDO的基因组谱与原发肿瘤的基因组谱高度相似，且PDO药物反应可以重现临床上患者的反应。然而，与其他所有肿瘤模型一样， PDO也不能免于体外模型的进化。由于癌细胞固有的基因组不稳定性也可能导至类器官模型连续增殖过程中出现遗传改变。
二、肿瘤模型进化的机制 那肿瘤模型是如何进化的呢？总的来说，肿瘤模型进化的机制主要来源于三个方面：克隆动力学、持续的基因组不稳定性以及由模型扩增的瓶颈影响。 在癌症模型中观察到的基因组进化可能是预先存在的异质性的结果，因为预先存在的肿瘤亚克隆的克隆动力学将导至其相对丰度的变化。罕见的原发性肿瘤亚克隆可以扩展并成为模型中的主要亚克隆，从而改变模型的分子景观。 其次，基因组进化可能是持续的基因组不稳定性的结果，这可能导至模型在增殖后有新遗传改变的积累和固定 ( a ) 。无论肿瘤模型是否反映了先前存在的亚克隆的扩增，还是新克隆的出现或两者均有，基因组进化到底是随机还是确定性过程？这取决于它是受遗传漂变影响还是遗传选择的结果 ( b ) 。另外，在任何一种情况下，与模型建立和肿瘤模型扩增相关的瓶颈 ( 包括：培养条件改变、冻存和解冻、遗传操作等 ) 都能够促进和加速基因组进化 ( c )。
由于选择在塑造肿瘤模型的基因组景观中起主要作用，因此评估模型进化是否反映了患者自然发生的肿瘤进化是很重要的。来自细胞系和PDX的数据表明癌症模型和患者中肿瘤进化会有不同轨迹。对AML ( 急性髓系白血病 ) 中基因组和功能异质性的分析表明，AML创始克隆不一定是小鼠模型中的AML起始克隆。在实体肿瘤中，在原发性肿瘤中常见的复发性癌症特异性CNA事件往往在PDXs和细胞系中消失。 因此，在自然人类环境和人工模型环境下，肿瘤的基因组景观由于不同的选择压力进化过程不同，导至癌症模型与其起源肿瘤的逐渐产生基因组差异。 三、对科研和医学临床应用的影响 肿瘤模型的进化是否会转化为具有生物学意义的细胞特性？答案是肯定的。肿瘤模型的基因组进化对研究和临床转化的影响取决于它们是否会影响功能检测的结果。 （一）表型后果 肿瘤模型在扩增中出现的基因组变化以及表观遗传进化，会影响所有肿瘤模型的表型改变。对C57BL / 6的两个亚株的基因工程小鼠进行表型分析表明，在多种生理、生化和行为中，两株小鼠都具有显著的表型差异，产生变化的范围从血压、眼睛形态一直到骨骼结构和空间记忆等。 另外，从多个实验室收集的27株MCF7细胞系在相同培养条件下的倍增时间变化多达3.5倍。形态学特征，如细胞大小和形状，也大不相同，这些形态变异就与基因组变异相关。
（二）影响阿凡达实验 肿瘤模型的进化还会影响“阿凡达实验”的结果。所谓“阿凡达实验”，也称为共同临床试验，即将患者的药物反应与来自他们肿瘤模型的药物反应相匹配。这样，用肿瘤模型测试的药物可以帮助指导该患者的临床治疗过程。有一些共同临床试验结果表明了患者的药物反应与其PDX和PDO之间的高度一致性。然而，还有很多模型药物反应与患者反应不匹配的情况。这种差异可能是由于基因组进化导至的肿瘤模型克隆组成的变化。 未来还需要进一步分析以评估癌症模型的进化以及肿瘤微环境的差异，在多大程度上限制了它们的使用以及如何克服这些限制。
（三）影响肿瘤模型生物库 人们使用大量的癌症模型，目的就是为了获得肿瘤患者群体的分子特征，并通过建立相应的模型生物数据库来查询和识别与特定分子特征相关的表型 ( 例如，与基因突变相关的药物敏感性 ) 。 总体而言，大群细胞系，PDX和PDO反映了各自癌症类型的基因组景观。但是，连续传代会使模型群体与患者群体产生倾斜。所以，在肿瘤模型进化的过程中建立生物库，我们需要问这两个重要问题： 1.整个队列在多大程度上代表了患者群体？ 2.这些群体中分子特征的稳定性和可靠性如何？ 考虑到肿瘤模型的建立和早期扩增期间基因组进化最快，所以在PDCL和PDX中，用于表征肿瘤特征的最佳时间点可能在p5和p10之间。还有一种新的做法，即首先生成PDX，然后从中派生出PDO。因为异种移植物的衍生成功率通常较高，而类器官更易于在高样本量的要求下操作和研究。但是由于模型被转移两次，从患者到小鼠，然后从小鼠转移到细胞培养中，基因组进化可能更多。
（四）对筛选目的的影响 肿瘤模型的基因组进化可以极大地影响化学和遗传筛选。比如一些化合物对肿瘤模型的显著作用，可能只是在这个特定的细胞系中有效果。在遗传功能丧失实验中，这个问题可能会加剧，这通常涉及遗传操作和抗生素的使用。 CRISPR文库筛选可能最容易受此问题的影响。 首先，将Cas9和指导RNA引入细胞通常涉及两个选择步骤，从而实现更多的克隆选择。 其次，在该过程中会使细胞能够耐受DNA切割的被选择，从而产生遗传改变。最近的两项研究表明，CRISPR-Cas9的基因组编辑导至针对具有功能性p53途径的细胞被选择。 第三，CRISPR筛选结果需要基于筛选细胞的拷贝数景观进行校正，这通常使用亲本细胞系的CNA图谱；然而从野生型细胞株的原始分析到用CRISPR-Cas9细胞株进行实际筛选时发生的CNA进化越多，拷贝数效应的计算校正就越不准确。
（五）对重现性的影响 当在一个实验室中获得的结果不能在另一个实验室中复制时，我们应该从中考虑一下是否是由于基因组进化产生的影响。例如，采用错配的和野生型对照的C57BL/6 基因工程小鼠在Jnk2 ( 也称为Mapk9 ) 对在肝损伤中的作用中研究结果完全相反。诸多研究都表明基因组进化可能危害癌症研究的重现性，但是现在还不能判断这种影响究竟有多大。 四、解决策略 我们确定了肿瘤模型的潜在风险，就需要就设计和实施缓解策略，以正确评估和控制基因组进化，从而减轻许多风险。首先，对肿瘤模型在扩增过程中进行跟踪和报告 ( 如对基因组进化进行常规检测 ) 。在长期扩增后或当肿瘤模型经历诸如遗传操作或单细胞克隆的强烈瓶颈时，还需要评估多样化。由于细胞株系之间的遗传距离与表达距离和药物反应距离非常相关，因此可以采用低通全基因组测序，以准确评估细胞系多样化。在进行功能实验的同时表征肿瘤模型的基因组特征是可取的和可行的。当细胞系错误识别和支原体污染成为细胞系研究中的主要问题时，期刊开始要求作者确认细胞系身份 ( 使用DNA指纹识别 ) 和支原体污染状态。可以设想细胞系遗传多样化评估可能成为未来发表文章的先决条件。 通过调整实验方案使得基因组进化最小化，降低表型效应。首先，在细胞初始鉴定之后，建议使用最小化的细胞培养技术来避免不必要的传代；其次，保持培养条件尽可能恒定，因为即使是微小的变化也可能导至克隆选择；另外，当可以使用基于群体的分析时，应该避免单细胞克隆。总之，我们需要更好地模仿人类肿瘤环境，减轻人为选择压力使基因组进化最小化。 总结 这篇综述，我们回顾了肿瘤模型中基因组不稳定性的研究现状，并论述了其生物学起源及其对基础研究和肿瘤精准医学的影响。虽然肿瘤模型的基因组进化的危险值得注意，但是采用缓解策略，这种自然现象也可以通过创造性方式加以利用。未来，可以利用肿瘤模型的动态性质来寻求新的研究途径或以新的方式解决问题。 参考文献 Genomic evolution of cancer models: perils and opportunities doi: 10.1038/s41568-018-0095-3 |
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