《Nature》重磅！“甲基化游离DNA测序”新方法突破液体活检重大瓶颈

癌症是威胁人类健康的重要疾病，癌症早筛对于癌症的预防和治疗意义重大。今天小编为大家解读一篇癌症早筛和区分癌种的基因测序新方法，该文刊登在《Nature》，原文题目为Sensitive tumour detection and classification using plasma cell-free DNA methylomes。

目前，肿瘤诊断和治疗的金标准是肿瘤组织活检，但随着对肿瘤研究的深入，科学家们发现，这一金标准并不完美，存在一定的局限性，如：因肿瘤的动态变化，首次诊断的组织活检可能无法反映当前肿瘤状况（具有一定的滞后性）；局部取样可能无法反映全身癌变情况；组织活检具有侵入性，会出现多种潜在并发症，重复取样受限等。

一、液体活检能够弥补组织活检的不足

随着科技的进步，非侵入性、且可在不同时间点重复取样的液体活检技术得到迅速的发展，因其正好能够弥补组织活检的不足，使得其在癌症检测方面应用的研究日益增多，因而备受关注。（注：因液体活检不能提供病理学诊断及蛋白表达检测的重要信息，目前尚不能取代组织活检）

二、常规液体活检在早期癌症检测中的瓶颈

液体活检的主要研究对象是血浆游离DNA(cfDNA)。cfDNA是血液中细胞成分之外的小片段DNA，是细胞凋亡或坏死后释放入血的，在健康人血液中含量极微，而在癌症患者血液中显著升高。循环肿瘤DNA（ctDNA）则是由肿瘤细胞释放到血液中的DNA，属于cfDNA的一部分。

cfDNA vs ctDNA

ctDNA的分析具有很高的临床应用价值。目前，大多数液体活检采用基于血浆cfDNA的体细胞突变检测方法来检测ctDNA，然而，由于早期癌症患者高频突变数量有限，致使检测的灵敏度低。

三、DNA甲基化检测

早期癌症的筛查及治疗后微小残留病灶的检测往往需要检测灵敏度超出当前检测技术限制的检测方法。相较于体细胞突变检测，针对不同癌种组织的大规模表观遗传变化（DNA甲基化是目前研究的比较充分的表观遗传修饰形式）检测方法的灵敏度不依赖于患者高频突变数量，对于早期癌症的检测具有更大的潜力。

四、甲基化游离DNA免疫共沉淀测序

由于血浆cfDNA的丰度低且碎片化程度高，限制了大部分血浆甲基化特异性PCR检测方法的应用，相关检测研究也存在较大的挑战。虽然有科学家尝试利用全基因组甲基化测序（WGBS）进行甲基化的检测，但是，由于在亚硫酸氢盐转化过程中DNA降解率高达84%-96%，且检测成本高、信息覆盖不全面，导至检测到的癌症易感基因（CPGs）丰度低。

为了突破现有检测技术的限制，来自加拿大多伦多玛格丽特公主癌症中心的Shu Yi Shen等研究者开发了一种灵敏的、可分离、检测和分析低水平甲基化DNA的甲基化游离DNA免疫共沉淀测序（cfMeDIP-seq）方法。该方法将免疫共沉淀技术与高通量测序结合，通过对cfDNA中的甲基化DNA片段（富含CpG区域）进行特异性富集，提高检测效率。同时结合机器学习构建一种分类器，能够识别血液样本中癌症来源的DNA，并确定癌种。

cfMeDIP-seq技术简图

五、甲基化游离DNA免疫共沉淀测序的五大优势

（一）上样量可低至1~10ng

因多数血浆样本cfDNA含量远低于100ng，研究者优化了现有的低上样量甲基化DNA免疫共沉淀测序（MeDIP-seq，≥100ng），使得cfMeDIP-seq的上样量可低至1~10ng，通过大量的实验证实：该检测方法可重现MeDIP-seq（100ng）、简化甲基化测序（RRBS，1000ng）和全基因组甲基化测序（WGBS，2000ng）的检测结果。提示该检测方法的灵敏度高，准确性与其他检测方法相当。

（二）CpG富集倍数可达到上样前的2倍

研究者发现：与MeDIP-seq相比，cfMeDIP-seq在结直肠癌cfDNA甲基化检测中表现出更强大的检测重复相关性。由于结合了免疫共沉淀技术，其CpG富集倍数可达到上样前的2倍。同时，研究人员还将cfMeDIP-seq与超深度杂交捕获突变测序进行了比较，发现cfMeDIP-seq在ctDNA检测中有着较高的灵敏度。

（三）检测甲基化cfDNA追踪早期癌症ctDNA水平

研究者选取24名早期胰腺导管腺癌（PDAC）患者作为病例组，24名年龄、性别相当的健康人作为对照组，分别运用cfMeDIP-seq技术进行血浆cfDNA的检测，共识别出14716个不同的甲基化修饰区域（其中病例组9931个，对照组4785个）。通过检测两组参与者的组织样本，获得了45173个差异甲基化CpGs。结果发现：血浆cfDNA信号与来源于肿瘤组织的ctDNA中的DNA甲基化相关，提示该方法能够通过检测甲基化cfDNA追踪早期癌症的ctDNA水平。

（四）检测癌症的灵敏度高

研究者通过生物信息学模拟，检测了不同数量的差异甲基化区域（DMRs）、覆盖率和ctDNA丰度的检测概率。结果发现随着差异甲基化区域（DMR）的增加，即使在较低测序深度和ctDNA丰度下，检测灵敏度也随之增加。提示：该方法的检测灵敏度高。

（五）筛查早期癌症的同时高准确率的区分癌种

研究者对来自7个癌种[胰腺导管腺癌（PDAC）、结直肠癌（CRC）、乳腺癌（BRCA）、肺癌（LUC）、肾癌（RCC）、膀胱癌（BLCA）、急性髓细胞性白血病（AML）]的病例组及健康对照组的189份血浆样品进行cfMeDIP-seq检测。结果发现：该检测方法可以通过识别特定的ctDNA甲基化谱区分癌种。紧接着，研究者进行了机器学习分析，基于大数据创建能够“识别血液样本中肿瘤DNA存在”以及“确定癌种”的cfDNA甲基化分类器，结果显示：该分类器主要由肿瘤特异性DNA甲基化模式驱动，而不是由肿瘤微环境中的血细胞或细胞组成的波动驱动，能够在早筛的同时高准确率的区分癌种。

总结：

该研究将高通量测序技术、免疫共沉淀技术及基于大数据的机器学习方法相结合开发了cfMeDIP-seq检测方法，通过大量的实验证明：cfDNA甲基化特征检测作为非侵入性手段，在早期癌症检测的灵敏度、准确性、成本效益以及区分癌种等方面都有巨大的发展潜力，为未来癌症早筛及癌种诊断的非侵入性检测带来希望，但该方法还需要在独立样本中进行验证。

另外，需注意原文没有提及的一些细节问题：如：由于cfDNA半衰期短，在研究过程中需要特别注意采样试管的选择、样本储存的环境以及样本处理方法是否严格的按照标准执行，以确保检测样品的质量合格，从而保障检测的准确性；在临床研究中一定要把好大数据关，即大数据的数量和质量，以提高机器学习的准确性，进而保障检测结果的准确。相信随着人类对癌症认识的加深、科技的发展、检测技术的革新，未来癌症早筛及癌种诊断的非侵入性检测或可成为现实。