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IVD质量管理系列の技术篇 胶体金免疫层析法(上)

2018-12-11 00:00| 编辑: 小桔灯网| 查看: 7172| 评论: 0|来源: 小桔灯网丨作者:大漠孤鹰

摘要: 导读:(点击查看)1.IVD质量管理系列分享の开篇2.IVD质量管理系列分享の技术篇 免疫学知识(上)3.IVD质量管理系列分享の技术篇 免疫学知识(下)4.IVD质量管理系列分享の技术篇 酶联免疫分析法(上)5.IVD质量管理 ...


导读:(点击查看)

1.IVD质量管理系列分享の开篇

2.IVD质量管理系列分享の技术篇 免疫学知识(上)

3.IVD质量管理系列分享の技术篇 免疫学知识(下)

4.IVD质量管理系列分享の技术篇 酶联免疫分析法(上)

5.IVD质量管理系列分享の技术篇 酶联免疫分析法(下)


一、 概述:

本篇主要介绍基于硝酸纤维素膜为载体,以胶体金颗粒为标记物的侧向免疫层析方法。该方法的基本反应原理与前述的酶联免疫法反应原理一致,目前基于侧向层析技术平台的产品,是发展最为迅速、技术最成熟并得到市场广泛应用的一类POCT产品。       

在本篇中介绍的胶体金技术平台分为三部分:胶体金溶液制备及影响因素探讨、胶体金试剂条(卡)制备、关键原辅料的质量控制。目前的类似产品有荧光免疫层析法、乳胶免疫层析法,因此读者可以代入自己熟悉的领域去理解和掌握本篇所介绍的技术知识,并恳请予以批评指正。


二、 胶体金溶液制备及影响因素探讨:

1. 胶体金试剂的组成结构(条式、卡式),如下图所示:


整个试剂条被贴于PVC底板上,由左至右分别是样本垫、金标垫、NC膜、吸水垫,如果装配成试剂卡,则将试剂条装入右侧的卡壳中,因此整个试纸条的制备包含以下基本过程:

1.胶体金颗粒的制备及质量控制;

2.金标记物的制备及质量控制;

3.金标垫的制备;

4.NC膜的制备;

5.样本垫的制备;

6.试纸条(卡)的装配;


2. 胶体金溶液制备:

2.1 制备方法概述:许多化学方法都可用于制备单分散体系的胶体金,但目前只有3种方法最为常用,而且所得金颗粒大小可控。这3种方法都是用还原剂将1%氯金酸水溶液还原,制备出球状金粒。通常还原剂的还原力越强,浓度越高,所得分散系中的金颗粒直径则越小(表2)。 

大颗粒胶体金可用柠檬酸三钠还原氯金酸溶液反应制得,根据还原剂柠檬酸三钠的用量不同,所得颗粒粒径一般在15~150nm范围。6~15nm的中等粒径金可用抗坏血酸钠还原氯金酸制得,这种方法制得的金粒平均粒径在12nm左右。目前技术所能制出的最小金粒粒径可达5nm以下,这种粒径的金粒需在二乙醚中采用白磷或黄磷还原法制备。这里主要谈的是制备20~40nm金颗粒(柠檬酸三钠法),因为这种大小的金粒最适于快速诊断测试使用。

柠檬酸三钠法是由Frens在1973年创立的,制备程序很简单,胶体金的颗粒大小较一致,广为采用。该法一般先将0.01%的HAuCl4溶液加热至沸腾,迅速加入一定量1%柠檬酸三钠水溶液,开始有些蓝色,然后浅蓝、蓝色,再加热出现红色,煮沸7~10min出现透明的橙红色。各种颗粒的胶体金制备详见表5-2。

上述比例制备的是标准浓度的胶体金溶液,如果想制备更高浓度的胶体金溶液(比如俗称的2倍、4倍金溶液),则将氯金酸溶液和柠檬酸三钠溶液浓度同比例增加即可(即波峰一致,λOD值显著升高)。

按照Frens法还可以制备出其它不同颗粒大小的胶体金出来,具体所需的粒径大小,需要根据不同产品的适用性和功能性实验来确定。许多研究证明用该法制备胶体金时金颗粒的大小是柠檬酸三钠用量的函数,基本的规律是柠檬酸三钠用量多,胶体金颗粒直径小,柠檬酸三钠用量越少,胶体金颗粒直径越大。


2.2胶体金溶液特性:

在加入还原剂之前,金离子100%都在溶液中,还原剂快速加入后,溶液中开始出现金原子,并且金原子浓度很快升高,直到过饱和,随后发生凝集,即长晶核,晶核的中心是11个金原子聚集形成的二十面体。晶核形成非常迅速,一旦形成,溶液中其它金原子就不断结合到晶核上,直到溶液中所有金原子消失。反应中,溶液中最初形成的晶核数(初核)决定了最终长成的金粒数量。如果溶液中氯金酸浓度一定,则还原剂浓度越高,初核数量越大,初核数量越大,最终的金粒则越小。       

因此,正确选择柠檬酸三钠的浓度就对胶体金生产至关重要。如果生产条件已优化好,所有的晶核将在瞬间同时形成,这样最终形成的胶体金颗粒将具有同样的粒径(即形成单分散胶体金体系)。实际中要获得单分散胶体金体系非常困难,很多时候胶体金体系不均一的原因就是因为没有把握晶核生长规律,结果制出的胶体金颗粒大小不一(批与批间金粒有差异),用这样的胶体金多数情况下不能制出稳定的结合物。

胶体金颗粒中心是金原子,周围吸附一层AuCl2-带负电,金颗粒之间存在相互排斥作用,而溶液中有H+层。这种双离子层维持了胶体金溶液的稳定性。电解质会迫使双离子层距离拉近,从而减弱静电排斥作用,进而导至金粒凝集,发生凝集时会伴随有胶体金颜色的变化,并且出现沉淀。氯化物、溴化物、碘化物几种电解质对胶体金体系稳定性的负影响以氯化物最甚,

胶体金在可见区的510~550nm波长范围内呈现单一吸收峰,颗粒越大,最大吸收波长越向长波长方向移动,峰宽则与颗粒大小的分布范围有关。最小的颗粒(2~5nm)呈橘黄色,中等颗粒(10~20nm)呈葡萄红色,较大颗粒(30~64nm)呈青绿色。颗粒越小,形状越接近球状,30~80nm的颗粒成偏心圆状,其偏心率与长轴和短轴比率有关。


2.3 影响胶体金溶液质量的因素:

2.3.1玻璃器具和制备用水:研究者已经注意到影响胶体金质量及其稳定性的几种因素,制备过程中器具若全部使用干净的玻璃器皿,溶液一律用0.2μm滤膜过滤后使用,采取这些措施后制得的胶体金很稳定。有研究表明即使痕量污物都会对胶体金制备带来不良影响,虽然经常可见推荐使用硅化玻璃器皿的说法,其实使用普通玻璃器皿同样也能制出高质量高稳定性的胶体金。

我们的经验是制备胶体金的所有玻璃器皿先用自来水把玻璃器皿上的灰尘流水冲洗干净,加入重铬酸钾洗液(重铬酸钾1000g,加入浓硫酸2500ml,加蒸馏水至10000ml)浸泡24h,自来水洗净清洁液,然后使用纯化水冲洗干净,烤箱(100摄氏度2小时)干燥后备用。通过此方法的处理玻璃器皿不需要硅化处理,而直接制备胶体金。也可用已经制备的胶体金溶液去浸泡所用的玻璃器皿的表面,然后弃去,再用双蒸水冲洗洗净,即可使用,这样效果更好,因为减少了金颗粒的吸附作用。这类处理的溶液必须作为胶体金溶液制备的专用器具,不得使用于其他用途。

也可以对胶体金溶液进行硅化处理,常见的处理方法如下,特别注意的是,这些方法读者应该自行进行验证后才能采用:

1. 用前经过重铬酸钾洗液浸泡过夜,然后纯化水冲洗干净。再将玻璃容器浸泡于含5%二氯二甲硅烷的氯仿溶液中2~5min,室温晾干,用双蒸水冲洗3次,烤干待用。

2. 10% NaOH溶液浸泡过夜,用双蒸水或去离子水冲洗,0.1%HCL溶液冲洗,去离子水冲洗,甲醇冲洗,用含3%氨丙基三乙氧基硅烷的甲醇溶液浸泡30min,用甲醇清洗,80度烤2h即可。

3. 用含5%二氯甲硅烷(甲基二氯硅烷)的氯仿溶液浸泡5-30min,用蒸馏水冲洗,180度2h干燥备用(塑料即用60度过夜)。


2.3.2 反应物浓度:生产金粒最常用的方法是Frens法,将100ml 0.01%(重量/体积)氯金酸加热至沸,然后加入相应量的1%的柠檬酸三钠溶液,反应液开始是灰白色,继续沸腾,变为深紫色,在1~3min后淡紫色中出现红色调,所得颗粒胶体一旦形成,无论是再延长反应时间或是再添加如柠檬酸三钠溶液,金的粒径都不再变化。有研究表明反应体积按比例增大后,最终的金粒径相应增大约20%,而且此时即使氯金酸或柠檬酸三钠量有20%差异,也不会对金粒径造成实质性影响,最初的晶核形成速率实际是一样的,并且在反应中始终一样。

试剂配制必须保持严格的纯净,所有试剂都必须使用超纯水或双蒸馏水后配制,或者在临用前将配好的试剂经微孔滤膜(0.45μm)过滤,以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。


2.3.3 反应物搅拌:这可能是最关键的物理参数,要使晶核形成较好,反应物必须充分混匀,充分搅拌使得反应器各处浓度和温度一致,如果浓度各处有差异,则各处的反应速率也随之不同。

对于一个慢速反应,反应物如何搅拌不是引起产物形状畸变的理由,但对于制金过程,反应在几秒内就已经发生,反应器中的反应物必须在反应发生前就达到浓度均一。因此,快速搅拌此时就显得格外必要,一定要有特别的搅拌装置来对反应器中的液体物料进行搅拌。

小规模生产时,可用搅拌子搅拌。反应器置于磁力搅拌器上,为了快速混匀,搅拌子要高速转动。

仔细观察图1,可发现有涡旋现象,这实际上是一种不正确的搅拌,因为此时液体在很狭窄的区域转动,而不是在整个反应器内回流。反应器直径越大,涡旋有害效应越明显。在小容量反应器中,譬如500ml,即使有涡旋现象,生产的胶体金质量也不会太差。但在其它情况下,譬如当生产规模达到4L,涡旋的影响就很大了,所得金质量会很差,颗粒变大,并且偏心率很大。 

最好采用机械搅拌器,将机械搅拌器固定在马达上,借助马达将搅拌动力传给反应器中的液体物料使其混合。反应器要装备紊流片以免搅拌时形成涡流,紊流片实际就是固定在容器壁上的一些片条体,它可以促进反应器内形成紊流,抑制涡旋。反应器中要实现均匀一致地混合,取决于几个重要因素:反应器直径,搅拌子直径,紊流片厚度,旋转及搅拌速度。 

胶体金溶胶制备时,首先必须尽可能使反应物浓度均一,反应物浓度一旦均一,搅拌速度必须降低,否则金颗粒会彼此碰撞而形成大颗粒。因此,推荐在反应起始快速搅拌混匀反应物,随后慢速搅拌,不要形成湍流。


2.3.4 反应温度:所有的经典教科书都讲将柠檬酸三纳加入到沸腾的氯金酸溶液中,然后保持沸腾15min。而这个反应通常5min内已经完成,随后金颗粒大小不会再变化。那么如何沸腾,沸腾是否完全有必要呢? 温控是非常重要的,要使反应器恒温就需要正确选择加热系统。为了保持温度均一,避免出现干点,应该用热的液体环绕反应器,这种加热用液体用高分子油。对于小量生产,可以用油浴恒温器,反应器置于恒温器内,油温可用温度控制器控制。 


2.3.5 反应器的液柱压力:液柱压力仅在大规模生产时是一个需要考虑的重要因素。假如用批式反应器生产100L金,此时反应器内的液体物料很深。顶端物料的金是在大气压下制取的,而底部物料压力却是大气压与上边液柱压力之和,因此底部压力比大气压高,从而造成底部液体物料的沸点比顶部液体物料沸点高。


2.3.6 反应器材质:除过以上因素外,也要充分考虑反应容器和搅拌装置的材质对胶体金质量和稳定性的影响。小量生产时,常用特富龙搅拌子搅拌,使用特富龙材质主要是为了保证系统清洁。但搅拌子和反应容器接触点处有时会因转动和升降产生剪切力,这种剪切力有可能造成搅拌子出现瑕疵,金属暴露,胶体金与瑕疵处暴露的金属接触后就会在此聚集。必须时刻牢记,任何污染都会破坏金溶液体系。因此,推荐使用玻璃器皿,如果反应容器是钢质,则应该有玻璃衬里,而且衬里要经常检查,确保其完好无瑕。搅拌器的材质也应注意类似的问题,搅拌器通常也应是特富龙材质,因为特富龙不会与化学试剂发生有害反应。


2.3.7 反应溶液的pH值影响:有文献表明,胶体金制备时的溶液pH值影响胶体金颗粒大小和均匀度,呈现pH值越低,颜色越深,吸收峰向长波长方向移动。PH值越小,造成胶体金溶液分散相复杂化。各种颗粒聚集,造成多种吸收峰的出现。


3. 胶体金的质量检定

3.1胶体金颗粒直径测定:

用预先处理好的覆有Formvar膜的镍网浸入胶体金溶液内,取现放在空气中干燥或37℃烤箱烤干。然后在透射电镜下观察,主要观察金颗粒的大小,符合不符合所需要的颗粒直径,金颗粒是否均匀一致,有无椭圆形及多角形金颗粒存在。理想的金颗粒是大小基本相等,均匀一致,无椭圆形及多角形的金颗粒存在,还可以拍片放大后测量金颗粒直径的大小,然后用统计学处理,计算胶体金颗粒的平均直径及标准差,前者反映颗粒的大小,后者说明颗粒是否均匀一致。但这种方法实施起来相当困难,在实际工作当中,一般以吸收峰(λ)、峰宽(Δλ)、吸收峰处的吸光度值(λOD)三个指标来评价胶体金溶液:

吸收峰(λ):根据目的制备的胶体金颗粒大小,可以建立该目的粒径对应的吸收峰(如使用500-600之间全波长扫描),此指标用来评价制备的胶体金溶液是否符合预期要求。实际上,在现实工作中即使所有的条件均能够做到足够均一和稳定,依然每次制备的胶体金颗粒进行扫描时,得到的最大吸收峰会有微小的偏移,这个偏移就代表了与目的粒径的差异,因此建立的这个指标是一个范围,当然这个范围是越小越好(比如在±1nm之内)。

峰宽(Δλ):我们所需要的胶体金溶液,理想中的颗粒粒径是大小均一的,但实际上不能做到,一定是处于某个可接受范围内的粒径分布,因此可以建立能接受的粒径分布范围,当然这个范围越小越好,表明所制备的胶体金溶液粒径越均匀。

吸光度值(ODλ峰):所制备的胶体金溶液在最大吸收峰处的吸光度值代表的是目的粒径的浓度,吸光度值越大,目的粒径浓度越高,反之则越低。该浓度也影响到胶体金本省的稳定性,以及后续标记蛋白时的效率。


3.2 胶体金溶液的保存:不能低温冷冻,温度也不能过高,可在4-10℃储存数月有效。氯金酸及胶体金溶液对金属有极强的腐蚀性,而金属类的器具也能破坏胶体金溶液的稳定性,因此最好是使用玻璃容器,不得接触金属类的容器具。

 

参考文献:      

1.《丁香园.胶体金文献翻译专辑》,2007年

2.《胶体金免疫标记技术培训班》胡东维, 2001年

3. 《strips considerations for product development》.Millipore

来源:小桔灯网丨作者:大漠孤鹰

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