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IVD质量管理系列の技术篇 酶联免疫分析法(ELISA)(上)

2018-12-3 00:00| 编辑: 面气灵| 查看: 4248| 评论: 0|来源: 小桔灯网丨大漠孤鹰

摘要: 一、概述:体外诊断试剂企业所提供的产品,本质上讲是为检验医学提供了一种方法学,是一种经过严格验证的,具备追溯或溯源体系的检验方法。因此,提供IVD产品的实质提供了一套可靠的检验方法或程序,那么IVD产品就必 ...

一、概述:

体外诊断试剂企业所提供的产品,本质上讲是为检验医学提供了一种方法学,是一种经过严格验证的,具备追溯或溯源体系的检验方法。因此,提供IVD产品的实质提供了一套可靠的检验方法或程序,那么IVD产品就必然与我们通常意义上所说的检验方法本质上是一致的,有方法学天然存在的优势和必然的缺陷,理解这一点对我们后续理解不同IVD产品有很大帮助,本篇分上、下章节介绍在酶联免疫分析法中常见的反应原理,这些反应原理在整个免疫检测领域是通用的,掌握这些常见的方法学原理及其优缺点,读者能更好地理解免疫测定产品及可能存在的问题。

二、金标准:

提到检验方法,就不得不提“金标准”这个概念,当机体感染病原微生物时,要想使临床医师尽早采取适当措施进行治疗,人们就希望尽快知道机体被何种病原体感染。传统病原体感染诊断一般要经过这样一个过程:首先对可能存在病原体的体液或分泌物进行体外培养,然后再通过形态学、生物学和生物化学特性鉴定,以确定到底是何种病原体。这种方法通常称之为“金标准”。

“金标准”方法经常见于临床研究实验当中,当我们使用新方法学时,应与金标准进行临床符合性对比研究,当我们与对比试剂研究出现不一致时,用“金标准”方法进行判断。但是“金标准”耗时长,效率低而且不是万能的。某些不适合体外培养的病原体很容易培养失败,造成假阴性。如沙眼衣原体、肺炎衣原体和结核分枝杆菌、HCV病毒、HIV病毒。因此,人们希望追求一种更加简便快速的方法进行鉴定,免疫检验方法便应运而生。总的来讲有两类:一类是检测病原体抗原(或核酸)而直接反映病原体感染;另一类是检测机体因对病原体的免疫应答而产生的抗体,间接反映病原体感染的方法。

常见的免疫测定中,因标记物不同而衍生不同的检测方法,如酶联免疫法(HRP/TMB)、化学发光法(ALP/AMPPD、电/钌)、免疫层析法(胶体金、荧光染料、乳胶、胶体硒等)、荧光免疫分析法(荧光染料、时间分辨/铕)。

三、ELISA类型及其原理:

ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。在测定时,受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体,也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型:

3.1双抗体夹心法测抗原

在临床检验中,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的特异性抗体,就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清,包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体,一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗,分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性,而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应,作“一步法”检测。双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原,但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原,因其不能形成两位点夹心。

3.2 间接法测抗体(测IgG/测IgM)

 间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗人IgG/抗人u链以检测与固相抗原结合的受检抗体,故称为间接法。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗人IgG/抗人u链建立检测相应抗体的方法。

间接法成功的关键在于抗原的纯度,特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质,例如以E.Coli为工程酶的重组抗原,如其中含有E.Coli成份,很可能与受过E.Coli感染者血中的抗E.Coli抗体发生反应。
间接法测定IgG中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性IgG。病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分。IgG的吸附性很强,非特异IgG可直接吸附到固相载体上,有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中,抗原包被后一般用无关蛋白质(例如牛血清蛋白)再包被一次,以封闭(blocking)固相上的空余间隙。另外,在检测过程中标本须先行稀释

(1:40~1:200),以避免过高的阴性本底影响结果的判断。

间接法测定IgM抗体,因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体,后者将竞争结合固相抗原而使一部份IgM抗体不能结合到固相上。因此如用抗人IgM作为二抗,间接测定IgM抗体,必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理,以除去IgG的干扰。

3.3 双抗原夹心法测抗体
反应模式与双抗体夹心法类似。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗体。此法中受检标本不需稀释,可直接用于测定,因此其敏感度相对高于间接法。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物,以检测相应的抗体。本法关键在于酶标抗原的制备,应根据抗原结构的不同,寻找合适的标记方法。

3.4 竞争法测抗体


当抗原材料中的干扰物质不易除去,或不易得到足够的纯化抗原时,可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多,结合在固相上的酶标抗体愈少,因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的,可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质,直接包被不易成功,可采用捕获包被法,即先包被与固相抗原相应的抗体,然后加入抗原,形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质,然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。竞争法测抗体有多种模式,可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合,抗HBc ELISA一般采用此法。另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合,洗涤后再加入酶标抗体,与结合在固相上的抗原反应。

3.5 竞争法测抗原

小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点,因此不能用双抗体夹心法进行测定,可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多,结合在固相上的酶标抗原愈少,最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。

3.6 捕获包被法测抗体(测IgM)


采用捕获包被法。先用抗人IgM抗体(抗人u链)包被固相,以捕获血清标本中的IgM(其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM)。然后加入抗原,此抗原仅与特异性IgM相结合。继而加酶标记针对抗原的特异性抗体(另一种模式则是加入酶标记的抗原,被固相捕获的特异性IgM结合)。再与底物作用,呈色即与标本中的IgM成正相关,如甲型肝炎病毒(HAV)IgM抗体的检测。

本方法要注意的是,通常采取通过稀释样本(1:1000)可以降低RF的干扰和非特异性IgM的干扰,因为急性期样本中IgM的含量很高,而RF相对低很多。另外,某些病原体感染后,持续存在低浓度的IgM抗体,作为急性感染性指征就无存在意义,所以样本稀释可以消除这类影响。有些试剂盒为了迎合临床使用而不进行样本稀释,这样导至在血中低IgM(非急性期)被检出而失去急性期诊断的意义,而且容易导至RF的干扰造成假阳性。

3.7 ABS-ELISA法
ABS为亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system)的略语。亲和素是一种糖蛋白,每个分子由4个能和生物素结合的亚基组成。生物素为小分子化合物,分子量244。生物素与亲和素的结合具有很强的特异性,其亲和力较抗原抗体反应大得多,两者一经结合就极为稳定。由于一个亲和素可与4个生物素分子结合,以生物素标记的抗体(或抗原)代替原ELISA系统中的酶标抗体(抗原),然后以酶标亲和素与固相结合的生物素标记抗体(抗原)反应,经洗涤后加入底物显色,显色强弱与相关待测物的浓度成正相关性。

3.8 小结:上述基于抗原抗体反应的检测方法类型,通用于常见的免疫检测方法中。根据需要,固相载体可以选择微孔板、磁珠/微球、乳胶/胶体金颗粒、醋酸/NC膜等,各个检测模式的基本原理及其适用范围都是相通的。

 

参考文献

《分子免疫学基础》,王重庆编著,2003.北京大学出版社。

《临床酶免疫测定技术》,李金明,2005.人民军医出版社。

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