NGS在肿瘤基因检测中的新动向：大Panel平台

肿瘤？癌症？

这两个医学上常见的词汇，人们常常互相通用，傻傻分不清楚。其实，它们还是有一定区别的：

癌症 = 恶性肿瘤 + 血癌

强调的是“病变程度”严重

肿瘤 = 恶性肿瘤 + 良性肿瘤

强调的是有“实体的组织”存在

肿瘤的病因是什么呢？

其实，肿瘤发病的根本原因是：

基因突变

人体大概有两万多个基因，其中和肿瘤有直接关系的大约有一百多个，这些基因的突变与肿瘤的发生发展密切相关。人的一生中，机体组织都在不断地进行新陈代谢，机体细胞通过不断地分裂维持组织的新陈代谢。而细胞分裂时，DNA复制过程中总伴随着随机性错误。绝大多数突变都不在关键基因或关键位点上，这样的突变对肿瘤的发生不会产生影响，因此肿瘤仍然是小概率事件

假设用一个数学公式来描述肿瘤的发生：

P(Tumor) = A x B x C x D

P(Tumor)：肿瘤发生的概率

A：细胞分裂次数

B：每次分裂产生基因突变数目

C：突变基因是致癌基因的概率

D：免疫系统清除肿瘤细胞失败概率

这个公式中：C对每个人来说都是一样，基因突变在DNA上是随机发生的。而我们所指的肿瘤高危影响因素：年龄、吸烟、饮食以及病毒等正是通过 A、B、D 三个因子来影响肿瘤的发生发展

举个例来说：年龄。人体每时每刻都存在着大量的细胞分裂，岁数越大，积累的细胞分裂次数就越多，A数值越大；同时岁数越大，人的免疫系统就越弱，免疫细胞对肿瘤细胞清除能力减弱，D值也就越大

肿瘤相关的基因突变

有哪些形式

在肿瘤细胞中，基因组存在较多的序列变异，包括：

点突变

序列的插入缺失

拷贝数变异

易位

基因融合

其他畸变

在这些变异中，大多数都是目前已有研究中，未观察到过的突变形式。不同癌症类型，也存在特异的突变形式。这些特异性突变往往主导着肿瘤的发展与演变

（图片来源：google.com）

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肿瘤NGS基因检测-平台

面对如此捉摸不定的肿瘤，我们现在已经有了强有力的手段对其进行检测：

NGS 

(Next- Generation Sequencing)

（图片来源：diatechpharmacogenetics.com）

二代测序，又称高通量测序。以高输出量和高解析度为主要特色，能一次并行对几十万到几百万DNA分子进行序列读取。不仅可以提供丰富的遗传学信息，还可以大大降低测序费用、缩短测序时间

2015年，美国提出”精准医疗”之后，中国也紧跟着在“十三五规划”提出的”精准医疗”计划。肿瘤基因检测，是精准医疗中最为活跃的一个方向，也是能在临床上被广泛应用的一个方法。很多肿瘤精准医疗产品，都是基于基因测序平台，进行肿瘤诊断和用药指导

在浩如烟海的肿瘤基因组中

如何高效地寻找并鉴定靶向基因

基于NGS的Panel检测，就是我们强有力的工具

Panel可以简单理解为：基因组上目标区域的集合。按照我们想要研究的目的，对肿瘤相关的多个位点和基因，进行选择和组合，从而构成一个Panel。通过捕获测序，二代测序的下机数据，会大部分集中在这些Panel区域内。与传统PCR检测技术相比，Panel检测的序列更长，基因更多，信息量更大，从而提高了检测效率

基于NGS平台，肿瘤个体化诊疗产品，集中在两个方向：

1、小Panel

针对几个特定基因进行设计，这几个基因都有FDA批准的靶向药物，且有明确的伴随诊断，定义为“诊断类”产品

2、大Panel

包含几百个基因，目前这些基因，多数没有对应靶向药物，定义为“咨询类”产品。“咨询类”产品检测的内容较多，其中也包括“诊断类”项目

Panel检测的临床应用

临床上，检测员通过对NGS测序数据分析，确定肿瘤相关基因的突变情况，再结合肿瘤用药信息，出具精准用药报告，为医生提供一份肿瘤治疗参考。就目前总体而言，NGS基因检测产品日趋成熟，价格下降，已经被越来越多的患者和医生接受。如果条件允许，肿瘤患者在手术或药物治疗后，最好是定期做NGS基因检测，评估肿瘤治疗的预后以及复发的风险

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大Panel平台成为NGS

肿瘤基因检测发展新趋势

大Panel平台的检测优势日益突显：

1. 较大的信息量

相比小Panel，大Panel能够对更多的肿瘤基因进行检测，相当于扩大了搜索范围，容易发现一些罕见的基因变异形式

2. 适合较高的深度测序

目前肿瘤NGS测序，都需要极高的测序深度，尤其是cfDNA样本（检测的基因突变频率较低）。如果使用全基因组或全外显子组测序方法，进行高深度测序，检测成本就相当昂贵，并且会造成严重的数据浪费。而大Panel则将成本大大的降低了

3. 可用于 TMB 和 MSI 检测

TMB检测基本要求：Panel长度大于1Mb，而小Panel达不到这个水平。因此，小Panel不适用于肿瘤的稳定性（MSI）和肿瘤突变负荷（TMB）检测。2018年，CFDA首次批准了肿瘤免疫治疗药物在国内上市。这些药物，都需要参考TMB检测结果，才能决定是否能使用

市面上主流的大Panel检测产品

1. MSK 的大Panel

2017年11月15日，美国食品和药物管理局（FDA）宣布，批准纽约纪念斯隆·凯特琳健康中心（MemorialSloanKetteringCancerCenter, MSK）的“IMPACT肿瘤基因检测分析平台”应用于临床。IMPACT是一种更加灵活、全面的体外诊断检测，能够同时鉴定多种肿瘤相关的基因突变。IMPAC采用NGS测序技术，能够快速鉴定468个基因的突变以及其他的分子变化。可对患者这些基因上所有的重要区域进行测序，并能够检测到基因上所有蛋白编码区突变、拷贝数变化（CNV）、启动子突变和基因组重排。它同时也能够检测肿瘤组织中的 MSI 和 TMB ，这是FDA所批准的，首个基于NGS检测的大Panel多基因检测方法

（图片来源：efilecabinet.com）

2. FoundationOne 的大Panel

2017年12月1日，FDA 和 CMS 同时批准 Foundation Medicine qixia产品 FoundationOne CDx（F1CDx）用于肿瘤临床伴随诊断。这是首款突破性的，基于NGS的体外诊断产品，也是第二款FDA批准的基于NGS检测的大Panel产品。能对任何实体肿瘤进行诊断，在体外诊断领域具有里程碑式的意义。F1CDx 覆盖324个基因的遗传突变以及两类基因组特征，能够高效检测肿瘤基因的点突变、插入缺失、MSI 以及 TMB 等。与 FDA 之前批准的伴随诊断产品对比，F1CDx 的总体准确率可达到94.6%。之前的伴随诊断产品，往往需要多次取样，才能做出药物治疗或参加临床试验的决定。而 F1CDx 无需频繁的侵入性检测，就能帮助医生获得更多信息，进行治疗选择。通过 F1CDx 一次检测，患者和医生就能评估多种病程管理方案

（图片来源：foundationmedicine.com）

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如何捕获Panel区域片段

说了这么多大Panel的好处，下面我们来看看Panel的一些实际操作吧。首先要捕获目标片段，分为两种方法：

1. 探针杂交捕获

根据核酸序列互补原理，设计与目标序列互补的特异性探针，并将其合成在液相或固相芯片上。把样品基因组DNA随机打断成小片段，加上测序接头后与探针进行杂交（如果模板量不够，可以先进行PCR扩增，然后再与探针杂交）。最终，将目标区域片段捕获下来，经过回收和构建文库就可以上机进行二代测序了

固相杂交捕获技术：

将探针连接固定在固体支持物上，“基因芯片”是其典型代表。与样品杂交后，先清洗未杂交上的DNA片段，再将与探针杂交上的DNA片段洗脱下来，进行PCR扩增，构建高通量测序文库

液相杂交捕获技术：

在溶液环境中进行，将带有生物素标记的探针，与目标DNA进行杂交。再通过“生物素--亲和素”的反应，使目标DNA片段锚定在带有亲和素的微珠上。然后通过洗脱、富集和PCR扩增完成测序文库的构建。目前液相杂交系统逐渐成为基因捕获主流。液相杂交探针分“DNA探针”和“RNA探针”，RNA探针特异性要比DNA探针好，现在市场上的液相探针大多是RNA探针

2. 多重PCR扩增捕获

该技术是利用多重PCR扩增、富集样品基因组中，目标区域的DNA片段。再进行文库构建和高通量测序（在PCR扩增过程中会加上测序接头序列，无需进行额外的接头连接和扩增反应）。其特点是目的明确、应用灵活、价格低廉、分析简单，可以产生超高的测序深度，并能检出超低频突变位点，所以尤为适用于肿瘤等疾病的临床检验与科研用途。目前，已有公司通过该技术，将基因捕获流程从多步简化为一步，只需要通过一轮PCR，就能精准捕获目标基因并完成靶向测序文库制备，人工操作时间缩短到5~10分钟

多重PCR也存在一些缺点，其中一个是它对大Panel的兼容性较差。随着扩增片段数的增加，多重PCR引物设计难度逐渐增大。目前市面上的大Panel产品基本都是基于探针杂交捕获技术

后续讲解内容

后续的文章，会对肿瘤基因检测NGS大Panel平台的，实验技术原理和信息分析内容进行讲解，包括以下内容：测序文件构建，分子标签技术，上机测序，下机数据拆分，数据质控，SNV/Indel检测，CNV检测，基因融合检测，TMB及MSI分析，突变结果注释，结合用药信息出具检测报告等，敬请期待～