感染性疾病现场快速检验技术的现状与未来

21世纪，感染性疾病仍然是全球公共卫生重大威胁，疟疾、HIV等传染病导至发展中国家的发病率和死亡率不断上升。同时，由于国际贸易往来、全球旅行的增加，碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌、耳念珠菌等重要耐药菌在全世界范围出现，迫切需要开发敏感、快速、特异、稳定、低成本和便于使用的诊断方法，促进早期合理治疗，阻止疾病传播。

POCT由中国医学装备协会POCT装备技术专业委员会定义为：在采样现场进行的、利用便携式分析仪器及配套试剂快速得到检测结果的一种检测方式。快速的现场检测避免了多次就诊或转诊，减少对经验治疗的依赖，从而促进抗菌药物合理使用。POCT检测的靶标通常是微生物抗原和抗原特异的患者血清抗体，以及病原体核酸或代谢物。本文介绍感染性疾病现场快速检验技术的临床应用现状，以及推动该领域前进的未来方向。

病原体抗原直接检测

大多数POCT快速诊断使用侧流免疫层析(lateral flow immunology assay, LFIA)技术。例如目前应用广泛的A群链球菌抗原检测、甲型/乙型流感病毒抗原检测、肺炎链球菌抗原检测、军团菌、肺炎衣原体抗原检测等。LFIAs用于抗原检测的性能关键取决于临床样品中分析物的浓度。分析物浓度低于检测的检测限可能会产生假阴性结果。最近研究表明快速流感诊断试验与逆转录PCR(reverse transcription－polymerase chain reaction，RT－PCR)或病毒培养相比灵敏度有限，并指出POCT试验阴性结果应谨慎解读，特别是当流感流行季节。儿科常规应用的A群链球菌快速诊断试剂的灵敏度约为86%，也存在一定的漏诊。目前临床诊断价值得到广泛认可的是隐球菌抗原试验。检测血清、脑脊液和手指全血标本的隐球菌荚膜多糖抗原侧流免疫层析技术(cryptococcal antigen lateral flow assay ，CrAg LFA)的临床诊断、疗效评估和风险预测能力得到肯定。WHO建议在隐球菌感染高发地区，CD4计数低于100个细胞/mm³的HIV患者在抗病毒治疗开始前应考虑进行血清或血浆CrAg筛查，并对阳性反应者启动抗真菌抢先治疗。近期CFDA将批准国产CrAg LFA试剂用于临床。

病原体特异性抗体检测

POCT抗体快速检测技术在临床应用较为广泛，其存在的问题主要是抗体阳性不能代表现症感染，尤其多种抗体同时阳性时给临床诊断造成困惑，同时也存在灵敏度低导至假阴性的情况。抗体检测更适合于流行病学调查或社区家庭初步筛查。HCV、梅毒、疟疾、登革热等抗体快速检测在传染病筛查中广泛应用。在社区呼吸道感染诊治中，肺炎支原体抗体、呼吸道病原IgM五联检等结合炎症标志物CRP、降钙素原(procalcitonin, PCT)、血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A protein, SAA)、IL－6等综合分析，有利于制定早期治疗方案。抗体检测除应用于血清或血浆外，OraQuick Advance快速HIV－1/2抗体检测在2012年被美国FDA批准为口腔液标本使用的非处方测试。由于样本采集的非侵入性，口腔液对患者可能更容易接受，也为出于隐私考虑不愿去医疗机构检测者提供选择，并降低医护人员的职业暴露风险。需要注意的是抗体检测可能无法确定急性早期感染，存在漏检的风险。因此，发展更为灵敏、特异的及时诊断技术仍然是感染病诊治和管理的重大需求。

病原体核酸分子检测

自PCR技术面世以来，核酸检测在感染病诊治中起到重要作用，尤其在结核分枝杆菌、苛养菌、病毒感染等领域，高灵敏PCR方法在疾病诊断上有决定性作用。但是，传统PCR技术需要严格的实验室条件和较高的人员技术要求。虽然PCR反应耗时通常仅2～3 h，但批量检测的要求使得大多数实验室的报告周期都在1 d以上。因此，POCT分子诊断成为新兴的研发热点。

微流控(microfluidics)是一门在微米尺度结构中操控纳升至皮升体积流体的技术与科学。近年逐步从研发实验室走向临床，成为新一代POCT主流技术。微流控芯片具有样品及试剂消耗少、分析时间短、微型化、集成化、自动化等优势，尤其核酸分析整合了从细胞裂解、核酸提取扩增到产物分析的全部测定步骤，降低了检测的复杂性，极大推动了POCT分子诊断领域的突破性发展。基于核酸扩增的第一个获得CLIA批准的POCT技术是Alere流感A/B测试(2015年)，该测试使用等温扩增和分子信标探针技术，15 min完成鼻拭子标本的流感病毒A/B检测。2017年该公司推出二代产品，将检测时间缩短至5 min。另一项是Roche Cobas Liat系统，包括A/B型流感，A群链球菌(group A Streptococcus，GAS)和A/B型流感加呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)，检测需要15～20 min。目前感染病POCT分子诊断产品最全面的是Cepheid公司，其项目涉及医院获得性感染、危重感染、性健康/女性健康、病毒、等多个领域。其中Xpert MTB/RIF能在2 h内从患者标本中直接检测出是否含有结核分枝杆菌及是否对含有对利福平耐药的基因，被WHO推荐用于结核病的初始诊断。

整合一体化分子检测系统可简化样本检测流程、缩短检测时间、有效防止交叉污染，在检测性能上较抗原抗体检测具有明显优势，但其配套设备和试剂的高成本限制了在经济欠发达的地区的推广应用。同时，由于一种试剂盒检测的靶标病原较为单一，对不同种类病原体需要逐一检测，在紧急情况下难以满足需求且多次检测给患者医疗费用控制带来不利。

因此，高通量、多靶标病原体检测成为临床微生物检验技术发展的新目标。法国生物梅里埃Filmarray检测系统，在微流控芯片中分配出相对独立的多反应腔体，在每一个反应腔体中实现独立反应，从而达到多重反应的效果，实现了在单次反应中的多种病原体核酸检测，该系统目前具有血流感染、呼吸道感染、中枢神经系统感染和胃肠道感染多重病原检测试剂盒。纳米技术(量子点)和微流控技术的结合进一步推动了这项技术的发展。通过纳米微流控芯片，可以使样品使用量低至100 μl，灵敏度达FDA目前批准技术的50倍以上。一种新型集成纳米微流控芯片，可实现血清样品中HIV、HBV和HCV的高通量、多重检测。国内博奥生物的呼吸道病原菌核酸检测试剂盒(恒温扩增芯片法)可在2 h内检测8种下呼吸道病原体。复旦大学团队研发的便携式微流控恒温荧光检测仪(SC－MA2000，沪浦械备20170070号)，可实现多重病原体同步检测。

抗菌药物敏感性测定

除了病原体检测，快速准确的抗菌药物敏感性试验(antimicrobial susceptibility test, AST)在感染病诊治中至关重要。最近的研究展示了用于药敏检测的生物传感器和微流体装置的开发。Mach等通过在有/无抗菌药物的情况下在微流控芯片中直接培养临床尿液标本，然后检测16S rRNA水平测量细菌生长；斯坦福大学研究团队建立了一种基于微流通道的毛细阻力的药敏检测系统，通过变动流体毛细阻力通道的长度来改变液体流速，从而实现抗生素的浓度梯度。不同浓度的抗生素再进入后续的细菌培养腔，从而进行药敏试验。基于该平台的药敏试验只要3 h。另一个微流体AST平台是基于生物合成的应激激活途径，可准确测定16株金黄色葡萄球菌对苯唑西林的敏感性。这些方法目前尚在实验室研发阶段，一旦成熟将可大大缩短目前的药物敏感试验报告时间，实现精准抗感染治疗。

展望

感染病的现场快速诊断技术是当前转化研究的热点，不断推陈出新。但是，目前取得CFDA批准的POCT诊断产品仍然以抗原抗体检测为主，分子诊断设备及试剂并不多见。兼具高敏感性和特异性的POCT分子检测方法仍然是研发重点，具有潜力。尽管微流控技术优势明显，目前用于临床感染病诊断仍然需要克服如下瓶颈：(1)样品处理。临床检测系统应能有效处理更广泛的标本类型，如尿液、全血、唾液等；(2)研究设计上的创新概念与临床验证之间存在差距，微流控分子诊断平台的参数优化和应用评价仍需规范；(3)在资源有限的环境中POCT技术需要考虑的关键设计特征，如使用环介导等温扩增以消除对热循环的需要，使用干粉试剂以保证在高温下长期稳定，以及便于基层操作人员的简单易行的检测步骤等。同时，POCT的定位仍然是以家庭、社区、急诊和野外紧急救治等感染病检测为主，作为中心实验室确诊试验的初级筛查依据。选择合适的时间、合适的场所、正确地应用，POCT作为传统感染病诊断技术的有力补充，将为分级诊疗模式下的感染病诊治提供新的策略。