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必备|流式细胞术数据分析学习知识汇总!

2018-11-3 14:41| 编辑: 小桔灯网| 查看: 14782| 评论: 0|来源: ZSCI

摘要: 导读今天做一个流式细胞术数据分析知识汇总,不管是刚入门还是高手,都可以收藏学习!文章导读:1.FCM基础知识2.FCM数据分析(总)3.FCM数据分析之分子表达4.FCM数据分析之增殖、周期、凋亡5.FCM数据分析之外周血亚 ...
导读  

今天做一个流式细胞术数据分析知识汇总,不管是刚入门还是高手,都可以收藏学习!

文章导读:

1.FCM基础知识

2.FCM数据分析(总)

3.FCM数据分析之分子表达

4.FCM数据分析之增殖、周期、凋亡

5.FCM数据分析之外周血亚群


第一章 FCM基础知识

1、基本原理:

一定波长的激光束直接照射到高压驱动的液流,产生的光信号被多个接收器接受,一个是机关束直线方向上接受的前向角散射光信号。其他是在激光束垂直方向上接受的光信号,包括侧向角散射光信号和荧光信号,这些光信号被相应的接受器接受后,根据接收信号的强弱就能反应出细胞的物理和化学特征。


2、物理属性:

前向散射光(forward scatter)

FSC信号的强弱与细胞的大小相关。

侧向散射光(side scatter)

SSC信号的强弱与细胞内的颗粒多少相关。


3、化学属性:

1.荧光信号是人为通过不同手段将荧光物质结合在细胞上,是人为属性。

2.荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生,发射的荧光波长与激发波长不同;

3.每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色,通过波长选择通透性滤片,可将不同波长的散射光和荧光信号区分开,送到不同的光电倍增管。


4、免疫荧光染色

   

5、常见荧光素

根据激光及滤光片选取流式抗体染料


6、常见的荧光素染料组合


7、举例:


8、双或多参数荧光抗体的标记组合

1)单染


2)双或多染


9、流式主要实验对照及作用:

空白对照(未染色细胞):用以区分细胞的自发荧光和特异性荧光,避免假阳性的结果。

同型对照:使用与实验抗体相同种属来源、相同剂量及同种免疫球蛋白的相同亚型的抗体作为对照,用于消除抗体非特异性结合到细胞上而产生的背景荧光。


10、阴性/阳性的区分?

对于流式样本,由于细胞的自发荧光、荧光抗体会与待测标本中的细胞发生少量非特异性结合,在流式细胞仪上可检出一定的信号,这部分信号称为基础荧光阈值。

在流式标本检测的过程中,通常通过调节电压将阴性细胞的基础荧光域值于95%或99%的置信区间内,作为阴性对照可信区间设定。大于阴性置信区间的荧光信号为特异性荧光信号。

注意:流式图中的颜色为区分不同细胞群而人为设定,与荧光无关

1)红色线:空白对照;

2)绿色线:阴性(同型)对照,P2区域即为阴性区域)

3)蓝色线为实验组。


第二章 FCM数据分析(总)

1、单参数直方图

以分布直方图来显示,横轴为该参数测量强度的相对值,单位是道数,可以是线形或者对数。纵轴一般是相对细胞/粒子数。

横轴:参数测量强度的相对值;

纵轴:相对细胞(粒子)数

细胞DNA含量的检测(细胞周期分析)

2、二维散点图

能够显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系,横、纵坐标分别代表两个独立参数,平面上每一个点表示具有相应坐标值的细胞。


3、二维等高线图

用等高线来代表细胞数,在一条等高线上的细胞数相同,不同的等高线细胞数不同。


4、假三维图

纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参数,Z轴为细胞数。


5、三维图

任意选三个参数为X,Y,Z轴,构成一个三维图,每一群细胞根据各自参数处于一个相对独立的空间,三维图对比较复制的亚群的显示更为直观明了。


6、设门

FCM数据分析的目的是通过与适当的阴性对照进行比较,来确定所分析样本中表达标记物的细胞百分率。完成这一过程的第一步就是需要确定我们所要研究的目的细胞群,其术语为设门。

设门是指在细胞分布图中指定某一个范围或某一细胞性状的细胞群,并对其进行单参数或多参数分析。

根据门的形状分为:线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。

通过FSC/SSC散点图,设门(gata)得到目标细胞进行分析。

举例:比较A地和B地黄皮肤黑头发的年轻男性的比例?

总结

门(Gata)设置:指在某一张选定参数的直方图上,根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群,并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。


第三章 FCM数据分析之蛋白检测

1、测肿瘤细胞表面PD-L1的表达水平,活细胞获取

2、检测肿瘤细胞表面PD-L1的表达水平

关于A/W/H的说明:

1)信号检测时,每一个细胞通过激光,机器的探头都会检测到一个荧光信号,在内部产生一个电脉冲信号(波),这个信号机器记录为一个峰值,每一个峰值都有三个参数,高度(H),宽度(W)和曲线下面积(A),H 和W都是直接测出的,而A是根据机器的设置就算得出。

2)临床和科研中使用A的时候比较多,特别在DNA倍体测定时一定要使用A,此外做荧光分辨率、荧光灵敏度等性能测试时也使用A。不过临床应用中的一些实验也显示,使用H时具有更高的CV和分离度,对于弱荧光细胞的辨识是有优势的,因此选用H也是可以的。


总结

看图技巧:

1、先看横、纵坐标,了解检测目的;

2、看图形分布,直方图峰型越往右移,代表其荧光强度越强;

3、M1的确定是根据阴性对照细胞的基础荧光域值设定的,峰形右移,荧光信号大于基础荧光域值(M1),表示阳性(M2);

4、数据统计时,检测目的物一般用各Marker区内的细胞所占百分比或者用平均荧光强度表示;

5、几个直方图的比较,关键看Mark(M1,M2)的位置以及细胞数。


比较不同细胞中PD-L1的表达水平。


第四章 FCM数据分析之增殖、周期、凋亡检测

1、细胞增殖检测

CellTrace细胞增殖试剂盒含有细胞膜通透性非荧光酯,可通过扩散透过细胞膜进入细胞,并与胺基反应形成荧光分子。这种无荧光的酯进入细胞后,可被细胞内酯酶转化为荧光产物。活化的琥珀亚胺酯与蛋白质中的胺基基团共价结合,使染料能够长时间保留在细胞中。

随着分裂,荧光越弱



2、细胞周期检测

处于不同细胞周期的细胞DNA含量不同,G0/G1期细胞含有二倍体量的DNA, G2/M期细胞含有四倍体量的DNA,而S期细胞的DNA含量处于二倍体和四倍体量之间。

DNA荧光染料能与DNA结合,DNA含量的多少与荧光染料的结合量成正比,荧光强度反应了DNA吸收荧光分子的多少。通过流式检测就能反应细胞内DNA的含量,区别细胞周期的G0/G1、 S期和, G2/M期细胞的比例。


3、细胞周期分析核酸染料

细胞膜非通透性染料:PI(碘化丙叮)、EB(溴化乙啶),不能进入完整细胞膜,标记时需要通过固定等方法增加细胞膜的通透性。

细胞膜通透性染料:Hoechst、DAPI等能染活细胞的DNA,但需紫外激光激发。


4、增殖及细胞周期

增殖相关Mark:Ki67,Brdu,MCM2,PCNA。


5、Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡

正常细胞膜是不对称的,胞浆面含有带负电的磷脂(磷脂酰丝氨酸,PS)。早期凋亡时,细胞表面不对称性发生改变,PS外翻到胞外侧。

Annexin V是一种钙离子依赖的对PS有高度亲和力的磷脂结合蛋白,可作为探针识别膜表面是否有PS,从而识别凋亡细胞。

PI常用于鉴别死细胞。凋亡细胞的细胞膜仍然是完整的,所以PI不能进入早期凋亡细胞核内。



Annexin V:识别凋亡细胞

PI:识别死细胞


6、Caspase-3法检测细胞凋亡


7、PI法检测细胞凋亡

凋亡的细胞由于DNA 裂解成许多小片段, 小分子量的 DNA 片段穿过细胞膜进入乙醇溶液中造成流失,仅剩下大片段的 DNA,最终导至凋亡细胞内 DNA 含量减少。经 DNA 荧光染料碘化丙啶(PI)染色后荧光强度明显减小,形成一个 DNA 含量小于 2n(即 G1 期细胞) 的分布区, 称为亚“G1”峰。


第五章 FCM数据分析之外周血亚群

1、淋巴细胞分选


2、案例分析:总结


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