1.第二代测序技术

1.1 Roche 454 测序平台

Roche 454（Genome Sequencer 20 System）是第一个NGS测序平台，由美国454 Life Sciences公司于2005年推出，2007年被瑞士Roche公司收购。此后Roche公司在此基础上开发了Roche GSTitanium、Roche GS FLX+、Roche GS Junior和Roche GS Junior+。Roche 454是一种基于微乳液PCR和焦磷酸测序技术的测序平台。

Roche 454测序平台具有较长的测序读长和短耗时的优势，准确性高达99.9%，达到了与Sanger测序法相当的长度与准确性，并降低了测序成本。Roche 454测序主要应用领域有微生物群落多样性分析（如16s、18s、ITS扩增子测序）、复杂环境样品的宏基因组学研究、微生物基因组的从头测序、转录组测序、外显子测序、目标区域捕获测序和病原菌检测等。然而，Roche 454 平台也存在一些不足，比如焦磷酸测序试剂成本相对较高，样本制备相对较复杂，对重复和同种碱基聚合区域难以处理，以及试剂冲洗带来的错误积累等。随着测序仪器的更新，454平台无论从扩展性还是从成本来看都很难再次升级和改良，故Roche公司宣布自2016年逐步淘汰焦磷酸测序仪器的生产。

1.2 Illumina 测序平台

美国Solexa公司于2006年推出GA，2007年被Illumina公司收购，此后Illumina公司又开发了GAⅡX、HiSeq 2500、HiSeq 3000、HiSeq 4000、HiSeq X Ten、HiSeq X Five、NextSeq 500、MiSeq系列和MiniSeq系统。

该系统能够在一天内测序整个人类基因组和多达16个外显子组，NextSeq500运行75个测序循环只需12 h。此外，Illumina测序成本最低，因此应用最广泛，几乎涵盖了测序应用的各个方面，比如基因组学的全基因组从头测序、重测序、外显子和目标区域捕获测序；转录组学的转录组测序、数字基因表达谱测序、微小RNA测序和降解组测序；表观组学的甲基化测序、简化甲基化测序和甲基化DNA免疫共沉淀测序等。然而，Illumina平台由于读长较短，会导至后期用于数据删节和分析的费用增高。

1.3. SOLiD测序平台

SOLiD测序技术由美国Agencourt公司开发，2006年被ABI公司收购。ABI于2007推出SOLiD的第一个测序平台，2010年又推出SOLiD 5500XL。同Roche 454测序平台一样，SOLiD也采用微乳液PCR，不同之处在于其采用寡核苷酸连接测序。

SOLiD一次循环可产生75～110 bp读长，产生300 Gb的测序序列。同Illumina一样，SOLiD可用于全基因组重测序确定单核苷酸多态性、缺失和插入等基因组结构变异，也可用于目标区域捕获测序、染色质免疫共沉淀测序和RAN测序，但读长短、成本高和数据结果分析困难的不足使其应用受限。

1.4.  Ion Torrent PGM和Proton半导体测序

美国Ion Torrent公司自2010年被Life Technologies收购后陆续推出Ion Torrent PGM（2010年）和Proton （2012年），二者是介于第二代和第三代之间的测序平台，其核心技术是Ion Torrent公司开发的半导体测序。Ion Torrent PGM通量低，但速度快，成本低且仪器规模小，因此应用广泛，适合16s RNA测序、微生物和病毒的从头测序和重测序、目标区域捕获测序、单核苷酸多态性检测、短串联重复序列测序、混合感染鉴定和线粒体DNA测序等。但Ion Torrent PGM也存在因多次洗脱过程导至的错误累积、阅读高度重复序列和同种多聚序列时出错率高等不足。现有Roche GS Junior、Ion TorrentPGM和MiSeq 3种针对临床和中小型实验室的小型测序仪。

2.第三代测序技术

第三代测序技术是在第二代基础上增加读长，降低试剂成本，并且加快运行速度。其显著特点是单分子测序，即不经PCR直接进行边合成边测序，不仅简化了样品处理过程，避免了扩增可能引入的错配，而且不受鸟嘌呤和胞嘧啶或腺嘌呤和胸腺嘧啶含量的影响，因此第三代测序技术能直接对RNA和甲基化DNA序列进行测序。现有的第三代测序平台包括美国Helicos Bioscience 公司的HeliScope遗传分析系统和Pacific Biosciences公司的PacBio RS单分子实时测序系统。

2.1.  HeliScope遗传分析系统

HeliScope 遗传分析系统为第一个单分子测序系统，由美国Helicos Bioscience 公司于2008年推出。HeliScope遗传分析系统所需样本量较少且对样本质量要求低，可用于古生物信息检测。HeliScope遗传分析系统最常用于基因表达分析，如在哺乳动物基因功能注解计划中用Heli-Scope进行基因表达加帽分析。

2.2.  PacBioRS单分子实时测序系统

PacBio RS单分子实时测序系统由美国Pacific Biosciences公司于2010年推出。PacBio RS 单分子实时测序系统的优势在于读长，最新的PacBio RSⅡ读长可达20 kb。PacBio RS每次循环产生400 Mb序列，成本为2~17 美元/ Mb，与其他NGS平台相比，其通量低，成本高，且单碱基识别错误率高达14%，但可通过提高循环次数来改善，也可与第二代测序技术联合应用以降低成本并提高准确度。Rhoads 等最近的研究表明PacBio RS适合于从头测序、基因结构突变检测、复杂重复序列测序、发现基因亚型、4-甲基胞嘧啶和6-甲基腺嘌呤检测。

2.3.  纳米孔测序技术

纳米孔测序技术虽属单分子测序，但不同于HeliScope遗传分析系统和PacBio RS单分子实时测序平台，它无需进行合成反应、荧光标记、洗脱和电荷耦合器件（charge couple device，CCD）照相机摄像，实现了从光学检测到电子传导检测和短读长到长读长测序的双重跨越。英国Oxford Nanopore Technologies公司现已推出高通量的GridION和U盘大小的MinION测序仪。瑞士Roche公司、美国Illumina 和Life Technologies 等公司也在投资纳米孔测序，如Roche 投资了Genia Technologies和Stratos Genomics 公司。与其他NGS平台相比，纳米孔测序技术具有长读长、高通量、低成本、短耗时和数据分析相对简单的优势，未来纳米孔测序技术投入市场后有望在几小时、几百美元的成本内完成全基因组测序。

测序平台技术参数盘点

表1：各测序平台对比

参考文献:  

1. S Goodwin, JD McPherson, WR McCombie, et al. Comingof age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nature ReviewsGenetics, 2016.

2. Ellis, M. J. et al. Whole-genomeanalysis informs breast cancer response to aromatase inhibition. Nature, 2012.

3. Chan, M. et al. Development of anext-generation sequencing method for BRCA mutation screening:a comparison between a high-throughput and a benchtop platform.J. Mol. Diagnost, 2012.