纳米孔测序技术，会颠覆DNA测序市场吗？

原文以An ace in the hole for DNA sequencing为标题

发布在2017年10月11日的《自然》科技专题上

原文作者：Michael Eisenstein

纽约威尔康奈尔医学院的计算生物学家Christopher Mason喜欢在会议上表演一个“绝活”：他和同事先从志愿者手机上收集DNA样本，然后就能在一个小时内现场进行谱系分析，甚至叙述志愿者一天的生活细节。“我们能从留在手机上的DNA信息推测谁刚刚吃了橘子或者谁吃了猪肉。”Mason说。

Scott Tighe (左) 和 DavidGoerlitz 正在使用MinION设备，在南极的泰勒谷对微生物DNA进行测序。

图片来源：Sarah Johnson

Mason之所以能够进行如此快速的分析，主要得益于英国牛津纳米孔技术公司（ONT）研发而成的一种手持测序设备——MinION。MinION通过将DNA长链穿过纳米孔，探测由DNA中四种核苷酸引发的微小电流变化，从而读取序列信息。

Mason以一种轻松随性的方式大致展示了该设备的性能，而早期用户已经利用它取得了一些引人瞩目的科学成就。MinION在2015年监控埃博拉病毒爆发中发挥了重要作用，它曾到达过南极，甚至进入了太空。

然而大小相当于一幅扑克牌的MinION在全球测序市场上仅占据了一小部分份额。目前测序市场仍由位于加州圣迭戈的Illumina公司主导。Illumina的起步早了十年，而ONT及其用户也在努力克服技术挑战，特别是较高的出错率。与此同时，竞争企业希望对这种概念上很简单但技术上很复杂的测序策略加以创新，最终超越ONT。

艰难的开始

Illumina通用的DNA测序技术通过在DNA复制反应期间顺序读取掺入样品中的碱基，产生大量非常准确的短读段（reads）。然后，这些长度为几百个核苷酸的序列数据可以通过计算组装成含有数百万个核苷酸的“重叠群”（contigs）。

至于纳米孔测序技术，则是让完整的DNA片段穿过纳米孔，直接进行分析。

MinION的每个流通池成本为500-900美元，包含数百个纳米孔，因此可以同时分析许多分子。系统在每个孔上施加电压，随着酶稳定地牵引DNA通过，核苷酸阻断离子流动并产生微小的电流变化，最后由专业软件破译这些变化（参见“纳米孔测序”一图）。由此产生的长读段可达数千个核苷酸，简化了组装过程。

Image: Nik Spencer/Nature

自2014年发布以来，MinION的潜力令基因组学界兴奋不已，但早期用户遇到了许多挑战。“仅仅对单个细菌基因组进行测序就需要很多工作，因为产量很低，单读段的准确性也很低。”英国伯明翰大学微生物基因组学家Nicholas Loman说， 他是MinION最早的一批使用者之一。

Illumina的单个读段的平均准确度通常可达99.9%，而第一代MinION测定每十个碱基中就约有三个是错的。此外还有一些其他问题。“有时候一个流通池是很好的，但另一个却不知道因为什么原因只有三个孔能用，尽管它们都来自同一批次。”Mason说。ONT不愿意对这篇文章公开发表评论。

这些限制使得MinION的应用主要集中在以快速简单为至高要求的应用上，如病原检测。美国国家人类基因组研究所(US National Human genome Research Institute)基因组信息学负责人 Adam Phillippy表示：“如果想知道一封信件中是否含有炭疽杆菌，用MinION很快就能做到，尽管读段不完全准确。”

飞速的发展

Keith Robison是马萨诸塞州药物发现公司Warp Drive Bio的首席科学家，他表示现在的MinION已经成熟。更重要的是，ONT顶住了产品发布后受到的怀疑和不屑。Robison说：“MinION已经多次证明所有这些人都错了。”

源自大肠杆菌的孔蛋白以及流通池化学的进步已经将许多实验中单个读段的错误率降低至2-5%。数据输出的大幅提升使得研究人员能够通过同时对更多分子进行测序，更好地发现错误，并且读段长度从最初的约7,000个核苷酸跃升至今天的100,000个核苷酸。

Loman的团队已经将单读段长度增加到了近一百万个碱基。“在早期运行中，我们每次运行都能测定几百Mb。”加拿大安大略省癌症研究所的生物信息学家Jared Simpson说，“通过新的纳米孔，测序长度很快达到了Gb级别，现在每次运行可达5 Gb或10 Gb。”

该平台还受益于软件开发的迅猛发展。由于存在更多重叠，将长读段组装为重叠群比短读段容易，但纳米孔读段可能出现更多错误，而且处理长读段的计算量极大。

为了解决这个问题，Phillippy的小组设计了一种名为Canu的算法，在该算法中，传统的短读段组装过程被作为长度短段数据的补充。另一种软件工具——ONT的Scrappie则解决了因均聚物（包含多个连续相同核苷酸的序列，例如AAAAA）导至系统停滞而产生的测序错误。

适用于微生物测序

事实证明，MinION在传染病研究人员中尤其受欢迎。Loman与同全球病毒学热点研究区域的同事合作，共同监控埃博拉在西非以及寨卡在巴西的传播。“他们基本上能在48小时内建立一个测序实验室并使其运转，装备可以放在行李箱里携带上飞机。”加州大学圣克鲁兹分校的生物物理学家Mark Akeson说，他开展了纳米孔测序法方面的一些基础性研究，并且是ONT咨询委员会成员。

Loman认为这种可携带性是一种巨大的优势，但他强调大量的数据输出可能令人难以招架。“我们在巴西几乎要成功了，但设备过热却导至我的Mac崩溃。”

一些团队正在探索临床微生物学应用。澳大利亚昆士兰大学的生物信息学家Lachlan Coin开发了实时数据分析算法，用于检测血液样本中的耐药细菌。在利用培养细菌和旧流通池进行的早期测试中，Coin团队能在10个小时内鉴定出一个样本中的所有抗药基因。

Coin表示，现在的技术能让这一时间减半，但真实样本中人类DNA会覆盖细菌DNA，从而使一过程复杂化。他还认为，再过一年左右，将能够在6个小时内鉴定病人样本中的抗药基因。

另外一些研究人员则在探索宏基因组学，目标是全面描述样本中的所有生物。原则上，流通池中的各纳米孔可以用来同时检测不同的基因组。“你可以获得其中任何物种的完整基因图谱，包括细菌、病毒和人类DNA。”Mason说。

他利用纳米孔测序对脏乱的纽约地铁系统开展了宏基因组研究，此外还有对更加恶劣的环境（包括火星）进行分析的宏伟计划。Mason同美国宇航局的科学家合作证实，MinION在国际空间站零重力条件下表现良好。他和同事们希望有一天能将该技术带到火星，为寻找地外生命提供帮助。

而在地球上，佛蒙特大学的遗传学家Scott Tighe在南极麦克默多干河谷（McMurdo Dry Valleys）也运行了MinION，他的团队用了两个多小时对微生物样本进行测序。“设备停止运行的原因在于外面太冷了，电池无法继续工作。”与Tighe合作过若干项目的Mason解释到。

远大的目标 

Adam Phillippy等纳米孔方面的专家将微生物基因组组装视为“一个已经解决的问题”。如今，他们有了更高远的目标：含有数十亿个而非几百万个核苷酸的哺乳动物基因组。

2017年，包括Phillippy、Loman和Simpson在内的多机构研究团队称，他们仅利用MinION数据就完成了人类基因组组装，并实现了高连续性和精确度。Simpson表示，平均的重叠群大小达到百万碱基级别，精度值最高为99.44%。结合Illumina的短读段技术，该团队将准确度提升至99.96%，不过仍未达到组装项目通常所追求的最高标准99.99%。

不过，在人类基因组分析的其他方面，纳米孔技术仍有很大优势。例如，目前的人类基因组组装仍不完整，因为高度重复的区域无法进行短读段分析。

Karen Miga是加州大学圣克鲁兹分校的一名基因组学研究人员，她的团队表明，纳米孔能帮助研究人员填补这些空白，他们利用150千碱基对的读段重构了人类着丝粒。此前对该领域的研究是一片空白。据与Miga合作的Akeson预测，可能再过几年就能组装出真正完整的基因组序列。

纳米孔分析还非常适合发现表观遗传标记——单个核苷酸的微小化学修饰，可影响基因表达。大多数测序平台采用的是除去这些标记的样品制备方法，但纳米孔平台可直接分析修饰的DNA。

Simpson和来自约翰·霍普金斯大学的Winston Timp表明，他们能通过软件区分甲基化胞苷酸和正常胞嘧啶的电信号，准确度约为90%。Akeson也成功完成了相似的工作。“我们能检测到我们想发现的任何修饰。”Akeson表示，“它甚至能够发现小至两个氢原子的微小区别。”

展望未来

尽管在纳米孔市场中仅此一家，但ONT仍需面对长读段竞争者。加利福尼亚的太平洋生物科学公司（PacBio）凭借以极高的准确率测量成千上万个碱基的DNA片段而享有盛誉。PacBio的平台比MinION庞大且更昂贵，它最小的系统Sequel大约是冰箱的大小，售价35万美元，此外它也不能完全达到ONT的最大读段长度。

但PacBio的首席科学官Jonas Korlach指出，该系统能够准确产生平均长度10-18kb碱基的读段，最长读段可达100kb，同时PacBio因其高质量数据而在基因组学领域受到信赖。Phillippy说：“利用Pacbio的技术很容易达到99.99%的准确率。”

该技术仍然是他进行大规模基因组组装的首选。对于大型项目而言，它的速度更快：最近报道的利用纳米孔数据组装人类基因组耗时为PacBio的十倍。

一些用户发现纳米孔样本制备盒可能会得到无法预期的结果，一些DNA样本需要大量优化。“一些人用得非常好并且获得了良好的结果，但其他人仍在苦苦挣扎。”Robison 表示。在去年12月的一次演讲中，ONT首席技术官Clive Brown宣称：“公司正在投入大量努力，来帮助用户针对特定样品类型改进实验方法，从而优化结果产出。”

同样，该公司最大的优点之一——通过定期升级优化来提高性能——可能会给某些忠实用户带来困扰。例如，ONT最新的纳米孔就给习惯了旧技术的用户带来了难题。“这种情况已发生了多次，”Loman说，“这就是走在前沿的弊端，它们不会如你所愿长期保持不变。”

这些问题为竞争者制造了机会，比如瑞士的罗氏公司。2014年，罗氏收购了总部位于加州的纳米孔初创公司—— Genia Technologies。虽然罗氏对其系统保密，但Genia在2016年公开的一份文件中描述了“通过合成开展纳米孔测序”的策略，也即将DNA合成酶同蛋白纳米孔配对。

这种酶会读取目标DNA，并且利用带有化学标签的核苷酸合成互补序列。在每个碱基被添加到不断延长的DNA链过程中，它的标签被释放并穿过纳米孔，从而产生独特的电信号。

罗氏测序方案负责人Neil Gunn表示，虽然这项研究早于罗氏收购，但该技术的核心原则在很大程度上没有改变。“这非常符合产品的设计，”他说，“自那时起，我们一直致力于提高准确度、读取速度和测序长度。”Gunn指出，罗氏的平台将直接针对体外诊断领域，目标是超越竞争对手的准确度和可重复性。

 Robison认为罗氏的平台是潜在的强有力竞争者，早期研究显示，对于任何给定核苷酸，准确率在78%到99%之间。他表示：“他们的设备可能值得关注，但魔鬼总是在细节中，我们需要大规模地评估真实数据。”

不过，ONT也未曾止步不前。和此前的模型相比，两个最新的台式系统能产生更大的数据量。在2017年3月发布的GridION可同时运行多个MinION设备。相比之下，PromethION利用的是一种完全不同的流通池，并且专门为人类基因组尺度的项目而设计。

“很显然，他们希望该系统能在输出量方面同Illumina公司的平台一较高下。”Loman表示。这些设备已经提供给部分用户试用，但还没有相关公开数据。

虽然这些进展的结果尚不可知，但纳米孔测序毋庸置疑具有极大的优势。它有望为大众提供低成本且可靠测序结果的潜力令研究人员兴奋不已。“作为计算机科学家，我总是渴望获得更多数据。”Phillippy表示，“所有微生物实验室，甚至大学课堂都能自己测序，想想就觉得很好。”ⓝ

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