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细胞因子检测方法研究进展及其在眼内液检测中的应用

2018-7-30 00:00| 编辑: 小桔灯网| 查看: 4343| 评论: 0|来源: 眼界

摘要: 作者:李自强1,何引章2,陶勇2来源:中华眼科医学杂志(电子版),2018,8(3):140-144.DOI:10.3877/cma.j.issn.2095-2007.2018.03.008基金项目:国家高技术研究发展计划(863计划)(2015AA020949);首都医科大学附 ...

作者:李自强1,何引章2,陶勇2

来源:中华眼科医学杂志(电子版),2018,8(3):140-144.

DOI:10.3877/cma.j.issn.2095-2007.2018.03.008

基金项目:国家高技术研究发展计划(863计划)(2015AA020949);首都医科大学附属北京朝阳医院“1351人才培养计划”(CYXX-2017-21)

作者单位: 101399 北京智德臻和医学检验所1;100020 首都医科大学附属北京朝阳医院眼科2

通信作者:陶勇,Email:taoyong@bjcyh.com


【摘要】细胞因子是指由细胞分泌的、能调节细胞功能的小分子多肽,其在免疫调节、应答过程中发挥着重要作用。细胞因子检测方法主要包括生物活性检测法、免疫学检测法和分子生物学检测法。各种检测方法各有优势,不可相互替代。眼内液是指眼球中的房水及玻璃体液,与血液相比,眼内液细胞因子检测能更好地反映眼内的环境。近几年,细胞因子研究增多,检测方法也不断推陈出新。故本文中笔者拟对细胞因子的检测现状、进展及其在眼内液检测中的应用做一综述。

【关键词】眼内液;细胞因子;生物学;免疫学技术;分子生物学

 

Research progress of cytokine detectionmethods and theirs applications in intraocular fluid detection.Li Ziqiang1, He Yinzhang2, Tao Yong2.1Beijing ZhiDe Genecast Medical Inspection Institute, Beijing101399, China; 2Department of Ophthalmology, Beijing Chao YangHospital, Capital Medical University, Beijing 100020, China

Corresponding author: Tao Yong, Email: taoyong@bjcyh.com.

AbstractCytokine is a small molecule polypeptide secreted by cells, whichregulates cell function. It plays an important role in immune regulation andresponse. Cytokine detection methods include biological activity detection,immunological detection and molecular biological detection. All kinds ofdetection methods have their own advantages and can not be replaced each other.Intraocular fluid refers to aqueous humor and vitreous humor in the eyeball.Compared with blood, the detection of cytokines in the intraocular fluid canbetter reflect the environment inside the eyes. In recent years, cytokines havebeen studied more frequently, and the detection methods have been constantlyinnovating. In this article, the author intends to review the status andprogress of cytokine detection and its application in the detection ofintraocular fluid.

Key wordsIntraocular fluid;Cytokine;Biology;Immunological technique;Molecularbiology

 

细胞因子是由细胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白物质的统称,因能调节多种细胞的生理功能而得名。它在免疫细胞分化与发育、免疫调节、炎症应答及肿瘤转移等生理和病理过程中均起着重要的作用;并可介导细胞与细胞之间的相互作用,参与组织修复等。对细胞因子进行检测可以判断机体免疫功能,对于疾病的诊断、病程观察、疗效判断及治疗监测等均具有重要意义[1-2]。因此,临床中细胞因子的检测越来越受到重视。


一、细胞因子的检测方法


(一)生物活性检测法生物活性检测法是利用细胞因子特有的生物学效应,包括对细胞生长的促进或抑制作用、细胞毒性及诱导趋化作用等,来评估样本中相应细胞因子的含量和(或)活性。该类方法具体可分为细胞增殖和增殖抑制测定法、细胞毒活测定法、抗病毒活性测定法、趋化活性测定法及细胞因子诱导产物分析法[3-4]


1. 细胞增殖和增殖抑制测定法:该法的基本原理是利用细胞因子对细胞生长的促进或抑制作用,即通过观察被检细胞因子对细胞因子依赖性细胞的刺激或抑制作用,从而测定该细胞因子的活性水平。其中,3H-TdR掺入法、比色法、染色法及直接计数法都是较为常用的检测细胞增殖的方法[4]


2. 细胞毒活性测定法(靶细胞杀伤法):该方法的基本原理是细胞因子对指示细胞具有破坏作用;若将细胞因子与细胞共育,将会导至细胞死亡。因此,检测时将待测细胞因子作一系


3. 列稀释后再加入至指示细胞培养体系,检测培养细胞的死细胞数,以此作为判断指标,死细胞数量与细胞因子的活性应呈正比。制作细胞因子活性与剂量关系的标准曲线,并以此作为待测品活性定量测定的基础。


4. 抗病毒活性测定法(细胞病变抑制法):该法通常采用干扰素进行测定。干扰素可以诱导细胞产生抑制病毒合成的酶,从而保护细胞免受病毒感染。


5. 趋化活性测定法:该法的原理是细胞因子趋化细胞由细胞因子浓度低的地方向浓度高的地方定向移动。因此,可利用细胞因子化学增活性、细胞因子增强细胞随机运动能力的特性,采用琼脂糖小滴化学动力学试验进行检测。


6. 诱导产物分析法:某些细胞因子可刺激特定的细胞产生生物活性物质,通过测定所诱生的相应产物,可反映细胞因子的活性,如白细胞介素-6诱导肝细胞合成a1-抗胰蛋白酶等[4]。生物活性检测法所测定的均是具有生物活性的细胞因子。故前体分子、降解片断、与结合蛋白或可溶性受体结合的细胞因子及细胞因子聚合物等不能用此法测定。此外,细胞因子受体拮抗物、细胞因子的天然抗体和一些病毒编码的类细胞因子等会干扰测定结果。生物活性测定法虽然敏感性较高、可直接测定生物学功能,但需培养依赖性细胞株、特异性差、操作繁琐且易受干扰。其中,特异性差是最主要的缺点[2-3,5-6]


(二)免疫学检测法免疫学检测方法是眼内液检测的常用方法。免疫学检测法的原理是基于抗原抗体特异性结合,再通过酶、同位素及荧光标记等技术进行检测,从而最终定性或定量测定细胞因子的水平[1,7-8]


1. 放射免疫测定法:放射免疫测定法是将放射性同位素的高度灵敏性、精确性与抗原抗体反应的特异性相结合而创建的一种在液相内微量物质的定量测定方法。此法具有特异性高、敏感度强、精确度高及样品用量少等优点。其中,液相的竞争抑制试验还具有方便快捷的优点。但该法试剂半衰期短,结果的稳定性会受到影响;花费较高,且需要专门的设备;具有一定放射性,对人体会造成一定伤害;实验废物处理起来较为困难。基于以上原因,放射免疫测定法不能广泛应用于临床。


2. 免疫放射测定法:免疫放射测定法以放射免疫分析为基础。不同于放射免疫分析法使用放射物标记抗原,免疫放射测定法使用核素直接标记抗体再与被检抗原结合。标记抗原要根据不同的抗原选择不同的标记物,而不同的抗体可用基本相同的标记物标记,故标记抗体比活度高。且该法检测结果不受高浓度胆红素影响。


3. 酶联免疫吸附法:其基本原理是酶分子与抗体或抗体分子的共价相结合。这种结合并不会改变抗体本身的免疫学特性,酶的生物学活性也不会受影响。该结合反应发生后会出现颜色反应,最终通过对颜色反应进行测定来了解是否发生了相应的免疫学反应。酶联免疫吸附法目前有三种主要的测定方法,包括间接法、夹心法及竞争法,其中间接法是测定抗体最常用的方法。上述三种酶联免疫吸附实验中,检测细胞因子和细胞因子受体的夹心酶联免疫吸附法因其酶标记物容易制备、制剂安全稳定、保存期长及不使用放射物等特点,在疾病诊断和监控治疗方面显得越来越重要。但其对酶联免疫吸附法数据的解释与分析仍存在一定局限性,包括由于实验方法的限制,该法不能显示单个细胞所产生细胞因子的同一性;某些半衰期较短的细胞因子很难被检测到;由于细胞因子耐受细胞产生的细胞因子上升和细胞因子蛋白的降解,测出的水平可能明显地低估了潜在细胞产生的真实细胞因子抗体水平;该法不能完全代表被检细胞因子的活性,原因是其只能检测具有免疫反应性的细胞因子蛋白。近年来,随着研究的不断深入,高度优化的细胞因子酶联免疫吸附法试剂盒已上市。它能在检测时将干扰因素和非特异性反应降低至最低水平,从而使酶联免疫吸附检测法的敏感性和特异性进一步提升。


4. 化学发光微粒子免疫分析法:化学发光微粒子免疫分析法是以磁性微粒作为固相载体,结合化学发光技术,对待测样本进行检测。该法在磁性微球表面包被抗细胞因子抗体,同时用吖啶酯作为标记发光剂,定量检测细胞因子。


5. 流式荧光发光免疫微球分析法:其基本原理是基于流式细胞仪对荧光信号级数放大的特性,故将受检的可溶性因子附着于一些具有近似细胞直径的微粒上,从而对受检样品中的各种可溶性因子进行检测[9]。该法的整个检测过程均为类均相反应,其反应时间短、可直接读数、检测效率高且操作简便。但仪器设备开支过大,造成检测成本的高昂。流式微球技术采用夹心法分析策略,与传统的酶联免疫吸附分析技术相比,此方法可以同时检测多项指标。用已知的标准品和对照标准曲线就可以得出被测样本的浓度。此分析方法不受样本量的限制,而且可以得到一个样本的多个数据[2-3]


6. 液相悬浮芯片法[10-12]:液相芯片技术亦应用流式细胞术原理,以悬浮于液相中经过特殊编码、可识别的微球为载体,可检测多个生物分子。液相芯片的反应体系包括微球、探针分子、被检测物和报告分子。最常用的微球编码技术是光学信号(荧光、红外线、光散射及可见光)。微球内部的物质受激发后产生不同的信号,从而将不同的特异性反应区分开来(定性、分类)。微球通过表面修饰的功能基团共价连结于能与被检测物特异性结合的探针分子。报告分子通常是一种能与被检测物特异性结合的标记有荧光的分子(如抗体、抗原及核酸等)。报告分子可为不同的特异性反应提供检测信号(定量)。先将编码的微球与探针分子结合,再依次加入样品及报告分子。不同微球上的探针分子与样品中需要检测的各种目标分子进行特异性结合反应,目标分子再与报告分子发生特异性结合,即构成了一个液相芯片反应体系。此法可在同一混悬体系中对同一样品中的多种目标分子进行同时分析[13-17]


7. 抗体芯片技术[7]:抗体芯片技术的原理与酶联免疫反应的原理相似。该法预先将特异性细胞因子抗体以特定顺序及阵列排列在芯片上,再与标本进行反应,而后加入具有荧光标记的抗体,最终通过分析荧光信号得到检测结果。但是,抗体芯片技术仍存在一些问题,包括如何简化操作过程及增加检测的灵敏度等。这些问题导至该法目前还无法被普及。但因其一次实验能同时检测多个细胞因子和其他蛋白,样品需要量少,且具有很高的特异性等优点,已成为国内外研究的热点技术,具有非常广阔的应用前景。


8. 全自动免疫检测系统:全自动免疫检测系统首创纳米级玻璃反应管,其直径相当于人的发丝直径,管内包被特异性捕获抗体,头尾相连成三重复,嵌入反应板上的微流体通路。待测蛋白流经纳米级玻璃反应管后被捕获,再与反应板上预装的生物素标记的检测抗体(dAb-1dAb-2dAb-3dAb-4)杂交,最后通过荧光标记的链霉亲和素(Fluor)显色。每个纳米级玻璃反应管相当于传统酶联免疫吸附板的一个孔,在空间上互相独立,可避免传统多重检测单流路造成的抗体交叉反应,获得更宽的检测范围和更高的灵敏度,便于多靶点分析方法的开发[18-19]


9. 酶联免疫斑点法:该法基于酶联免疫吸附技术的基本原理而建立,可体外检测特异性抗体分泌细胞和细胞因子分泌细胞。酶联免疫斑点法采用的基本方法为可定量的夹心酶联免疫吸附法。具体操作步骤为,将特异性抗体包被在微孔板的聚偏氟乙稀膜上,把经适当刺激的细胞加到孔中,在37℃的CO2孵箱中温育,使已包被的抗体与分泌的待测因子相结合,将生物素化的特异性检测抗体加入到孔中,然后加入碱性磷酸酶,偶联的链霉亲合素需加入底物溶液,即在细胞因子出现的位置形成并表现为黑蓝色斑点,每个斑点代表单个分泌待测细胞因子的细胞。相对于其他单细胞水平检测细胞因子分泌能力的检测方法,酶联免疫斑点法更为简单、快捷、高效,且重复性好,同时具有更高的灵敏度,比常规的酶联免疫吸附剂测定法的灵敏度提高200倍。酶联免疫斑点法操作简单,且具有较高的特异性和敏感性,同时可以提供近似于体内的实验环境,为预示治疗或病理状态提供了帮助,故而现已在国内外广泛应用。


10. 流式细胞术(细胞内细胞因子流式细胞仪检测法):流式细胞术是建立在荧光抗体染色技术和流式细胞仪敏感的分辨力基础上的检测方法。该法主要用于细胞内细胞因子和细胞表面黏附分子的检测,通过特异性的荧光抗体染色,能够简单、快速地进行单个细胞水平的细胞因子或黏附因子的检测,精确判断不同细胞亚群细胞因子和膜分子的表达情况。该法简便高效、具有较高的灵敏度和精确度且操作安全,分析时间短、对标本要求不高,只要是单细胞即可进行分析。该法也可同时分析单个细胞的多种特征,只要同时应用多种分子探针即可。因此,流式细胞仪检测是一种在基础医学、临床医学及科学研究中有着广泛应用前景的细胞分析技术[20-23]


(三)分子生物学检测法分子生物学检测法是目前研究细胞因子的重要手段。分子生物学检测方法测定的被检物并非细胞因子,而是特定细胞因子的基因表达。信使核糖核酸(messenger ribonucleic acidmRNA)检测是研究基因表达和功能较为常用的方法[4,24-26]。常用的细胞因子mRNA检测法有Northern印迹(Northern blot)、逆转录\|聚合酶链反应(ReverseTranscription-Polymerase Chain ReactionRT-PCR)及核糖核酸酶保护分析等方法。NorthernblotmRNA检测的经典方法之一,可半定量分析mRNA的水平,但该法较为费时,难以进行多标本或多个靶向mRNA的同时检测。定量RT-PCR是几种常用方法中最灵敏的一种,由于RT-PCR扩增本身的特性,要获得非常精确的结果十分困难。近年来,随着分子生物学的不断发展,低丰度细胞因子mRNA含量检测和实时荧光RT-PCR技术取得了较大发展并应用到临床研究。实时荧光定量反转录聚合酶链式反应技术(RT-PCR)是在聚合酶链式反应体系中加入荧光基团,以荧光化学物质测定每次聚合酶链式反应循环后产物总量,最后进行定量分析的方法。该法具有高敏感性和特异性、重复性好,并且减少了聚合酶链式反应中的污染,可进行高通量标本的操作,并且有效地解决了细胞因子mRNA半衰期短和拷贝数少的问题,拥有更加广阔的临床应用前景。但目前的主要问题是如何防止假阳性和如何方便定量。相信随着,RT-PCR技术的研究发展,细胞因子的分子生物学测定方法将可应用于临床。二、各种检测方法的比较(一)生物学检测法与免疫学检测法的比较生物学检测法比较敏感,又可直接测定生物学功能,是最可靠的方法,适用于各种实验目的,是科研部门最常用的技术。但需要长期培养依赖性细胞株,检测耗时长,步骤繁杂,影响因素多,不易熟练掌握。免疫学检测法比较简单,迅速,重复性好,但所测定的结果只代表相应细胞因子的量,而不代表其活性,同时敏感度也低于生物活性检测法(10100倍)。


(二)免疫学检测法不同方式之间的比较


1. 酶联免疫斑点法相比酶联免疫吸附法的优势:酶联免疫吸附法通过显色反应,在酶标仪上测定吸光度,与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。酶联免疫斑点法也是通过显色反应,在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点,可直接在显微镜下人工计数斑点或通过计算机辅助的分析系统对斑点进行计数。1个斑点代表1个细胞,从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率(某些研究不仅要检测细胞因子生成量,还需检测分泌此细胞因子的细胞频率)。由于是单细胞水平检测,酶联免疫斑点法比酶联免疫吸附法更灵敏,能从20万~30万细胞中检测出1个分泌该蛋白的细胞;捕获抗体具有高亲和力、高特异性、低内毒素的单克隆抗体,在研究者以刺激剂激活细胞时,不会影响活化细胞分泌细胞因子。


2. 夹心酶联免疫吸附法的缺点:不能显示出单个细胞产生细胞因子的同一性和频率性的直接信息。


3. 流式细胞仪检测特点:其一,快速、简便。无需组织培养,可以全血分析,无需分离人外周血单个核细胞。其二,灵敏度高。具有高度灵敏的荧光标记与检测系统。其三,高效。能够在同一细胞内同时检测两种或更多种细胞因子,也可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞亚群。其四,接近生物体的分析条件。全血检测保留了细胞及生化微环境,可以更准确地反映体内状况。分子生物学检测法,被认为是一种重复性好、灵敏性和准确性都很高的检测方法。RT-PCR的出现,毫无疑问地成为了检测基因表达量最适合的方法之一。在细胞因子研究中,运用绝对定量的实时荧光RT-PCR对细胞因子进行mRNA检测,能够较早地从mRNA水平中检测到细胞自发性细胞因子的表达,在某种程度上可以被认为更具有前瞻性和敏感性[1,6-8]


(三)生物活性检测法、免疫学检测法和分子生物学检测法的不同和相关性在上述三种方法中,生物活性检测法是一种基本和必需的细胞因子测定方法,可以检测细胞因子在生物体内的活性状态,但此法特异性较差,操作繁琐,干扰较多。与之相比,检测的结果具有简单快速、特异性高、敏感性高及易于标准化等特点,但不能区别细胞因子的活性和非活性状态;同时,由于试剂厂家的不同及其他因素的影响,同样的标本所测细胞因子的水平可能存在较大的差异。因此,细胞因子检测的标准化以及质量控制问题有待进一步规范。二者可以配合使用,以排除部分干扰。分子生物学方法灵敏度较高,是目前检测细胞因子最敏感的方法。尤其适用于极微量的标本或仅有少数细胞才能表达细胞因子基因或细胞因子mRNA以低水平表达的标本。因实验灵敏度和操作环境等原因极易出现假阳性结果,故每次实验都应设立阴性对照。其二,有时细胞可表达mRNA,但并不翻译,使分子生物学方法的结果与生物学方法和免疫学方法检测的结果并不一致。其三,由于细胞因子的检测受到其生物学特性如局部性分泌、吸收利用率高及半衰期短等条件的限制,细胞因子的这三种检测方法只有在一定条件下才具有相关性。为此,在实际运用中各种检测方法不能随意地互相替代。有研究结果表明,联合使用这三种方法,可使细胞因子的检测取得更好的效果[5-7]


二、眼内液细胞因子检测的常用方法眼内液包括房水和玻璃体。房水是无色透明液体,由睫状突上皮细胞产生,充满前后房。房水含有丰富的营养,可为角膜、晶状体及小梁网等无血管组织提供营养。玻璃体位于晶状体后方,并充满晶状体后方的空腔,即晶状体与视网膜之间,具有屈光、固定视网膜的作用,空腔内液体为玻璃体液。由于眼内局部微环境的特殊性,检测血液指标往往不能准确反应眼内情况。而对眼内液微量细胞因子进行检测,可特异性地反应眼内环境,为医师对疾病做出准确判断和有针对性地治疗提供了依据。因此,眼内液细胞因子的检测在眼科疾病治疗方面具有重要意义。眼内液细胞因子检测常用的分析法主要为酶联免疫吸附法和液相芯片法。


1. 酶联免疫吸附法:该法是定量单种细胞因子的有效方法,且商品化试剂盒种类齐全,价格适中。但由于眼内液较少,房水通常仅在0.150.3 ml左右,所以眼内液样本量要大大少于血清样本。由于样本微量,酶联免疫吸附法只能检测眼内液样本中复杂细胞因子中的12个细胞因子的浓度,很难进行多个细胞因子间的比较,尚不能得到眼内液中各种细胞因子之间相互作用和整体变化的结果;此外,如果进行大量样本检测多个因子的检测,还存在操作繁琐、比较费时的问题[1,7-8,27-28]


2. 液相芯片法:该法主要采用的有流式荧光发光免疫微球分析法及Luminex液相悬浮芯片检法。液相芯片技术具有高通量、高灵敏度及高特异性的特点,非常适合于同时检测微量泪液样本中的多个细胞因子;对多个细胞因子水平进行全面监测与评价,比监测单个细胞因子更能反应疾病发生与发展的整体变化。利用液相芯片技术可同时检测多种细胞因子,分析各种细胞因子的变化及其相互之间的关系。尤其由于液相芯片技术具有高通量、自动化、快速、灵敏及靶标多元化等特点,并能克服泪液标本量少的缺陷,为此这项技术在泪液检测中具有广阔的应用前景。限制液相芯片技术在眼内液分析中广泛应用的主要原因有以下几个方面。其一,缺少配对的检测抗体。眼内液中含有大量的细胞因子,目前商业化的试剂盒所能检测的目标细胞因子仍有限。其二,需要进行不同液相反应条件(样本的稀释倍数、检测抗体的浓度等)的优化与匹配。其三,同一反应体系中存在交叉反应及基质干扰。其四,各种液相芯片技术及试剂盒所采用的标准不一致,不同研究所报道的各种细胞因子绝对值差异较大,需进一步统一相应的标准,并建立标准的实验方案,以增加各个研究之间的可比性[29-36]。对于其临床应用,高质量诊断用抗原和单克隆抗体的缺乏、商品化液相芯片试剂盒的缺乏以及昂贵的研制费用和居高不下的商业价格是制约的主要因素。今后,随着液相芯片技术的日臻成熟和完善,成本逐渐降低,同时分子标记和检测技术的发展将不断促进和丰富液相芯片的技术平台。相信液相芯片技术将进一步应用于眼内液中各种细胞因子的检测[37-47]


综上所述,近年来,随着相关学科技术的发展与进步,细胞因子的检测方法也在不断改进和发展,从而实现便捷、更精确的目标。相信细胞因子检测技术的发展也将能够推进眼内液检测技术的不断进步,从而为眼科疾病的诊治带来更大的帮助,更好地服务于科研与临床。


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