比PD-L1抗体疗法更好！抑制肿瘤外泌体PD-L1的分泌或可成为重要抗癌靶点| MD Anderson ...

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肿瘤-微环境相互作用在肿瘤进展、转移和治疗抵抗中发挥重要作用，并且越来越多的证据表明，肿瘤细胞衍生的外泌体可以通过转移分子（例如microRNA、mRNA和蛋白质）来系统地调节或重编程肿瘤微环境。PD-L1是一种经典的免疫表面蛋白，通过与受体程序性细胞死亡-1（PD-1）结合，抑制T细胞的抗肿瘤功能，有效保护肿瘤免受免疫监视。据报道，外泌体含有某些类型的蛋白质，包括促进癌症转移的膜蛋白，例如EGFR和MET。作为膜结合蛋白，PD-L1是否存在于癌细胞衍生的外泌体中，是否在肿瘤进展中发挥作用仍然未知。

研究人员通过连续离心从具有PD-L1表达或PD-L1敲除（PD-L1 KO）的MDA-MB-231（231）人乳腺癌细胞和4T1小鼠乳腺肿瘤细胞的细胞培养上清液中分离外泌体。透射电镜显示这些外泌体通常是球形的，并且是膜包封的，尺寸为30-100 nm。在从表达PD-L1的人乳腺癌细胞（231-PD-L1）和小鼠乳腺癌细胞（4T1-PD-L1）的培养上清中分离的外泌体中检测到PD-L1；在231-PD-L1 KO或4T1-PD-L1KO细胞培养上清中提取的外泌体虽然具有相似水平的外泌体标志蛋白CD63和CD81，但检测不到PD-L1表达。值得注意的是，外泌体分泌抑制剂GW4869的处理减少了231细胞中外泌体的产生（如外泌体标志蛋白CD63和CD81的减少或外泌体蛋白总量的减少）以及外泌体中PD-L1的水平，但对细胞裂解物中的PD-L1表达没有影响。此外，体外结合测定显示PD-1-Fc蛋白同时下拉231-PD-L1衍生的外泌体中的PD-L1（exo-PD-L1）和CD81。231细胞的免疫荧光（IF）染色和人乳腺癌组织的免疫组织化学（IHC）双染色证明PD-L1和CD63在多泡体（MVB）中的共定位，这是释放前细胞内外泌体的前体形式。这些数据进一步支持体外和体内的外泌体中存在PD-L1。

为了评估exo-PD-L1的生物学功能，研究人员首先想知道的是它是否可以将PD-L1转移至具有低（MCF-7）或无PD-L1表达的其他细胞（BT549-PD-L1 KO）。他们检测到PD-L1从exo-PD-L1转移至MCF7或BT549-PD-L1 KO细胞。 PD-L1蛋白的获得不是PD-L1基因表达的结果，因为这些细胞中缺乏PD-L1 mRNA。他们还建立了231-PD-L1 EGFP细胞，并在视觉上证明了231-PD-L1 EGFP衍生的外泌体向BT549细胞转移PD-L1 EGFP。为了验证这是否也在体内发生，他们将小鼠4T1-PD-L1 KO细胞与来自4T1-PD-L1 Flag（EX-PD-L1 Flag）、4T1-PD-L1KO（EX-PD-L1 KO）的外泌体或PBS共注射进入BALB/c小鼠的乳腺脂肪垫。5天后收获肿瘤。肿瘤组织切片的IF染色显示EX-PD-L1 Flag而不是EX-PD-L1 KO使得4T1-PD-L1 KO细胞呈PD-L1 Flag阳性。重要的是，流式细胞术分析的结果进一步揭示由外泌体转运的PD-L1位于靶细胞的表面上并且能够结合PD-1。这些结果表明外泌体能够将功能性PD-L1转移至其他细胞。

鉴于外泌体的PD-L1可以直接结合PD-1，他们接下来检查外泌体PD-L1是否影响T细胞功能。研究结果显示，exo-PD-L1显着抑制T细胞对BT549-PD-L1 KO细胞的杀伤作用。接下来，为了探索exo-PD-L1是否抑制CD3/CD28触发的T细胞激活信号通路，他们通过用植物血凝素（PHA）处理外周血单核细胞（PBMC）来诱导PD-1表达产生T细胞母细胞。结果表明exo-PD-L1以剂量依赖的方式显着抑制CD3/CD28诱导的T细胞的ERK磷酸化和NF-κB活化，以及PHA诱导的白细胞介素-2（IL-2）分泌，所有这些都是T细胞活化的指标。此外，来自其他癌细胞系的exo-PD-L1，如结肠（RKO）和肺（ HCC827）癌细胞在阻断T细胞活化中具有相似的功能。总之，这些数据支持外泌体PD-L1抑制T细胞活化。

接下来，为了评估exo-PD-L1在肿瘤微环境和体内肿瘤进展中的作用，他们测量了与EX-PD-L1 Flag、EX-PD-L1 KO或PBS共注射的4T1-PD-L1 KO细胞的肿瘤生长。与之前的报道一致，4T1-PD-L1 KO细胞中的PD-L1缺乏导至肿瘤显着消退；然而，EX-PD-L1 Flag而非EX-PD-L1 KO显着恢复了4T1-PD-L1 KO细胞的肿瘤生长。然后他们将4T1-PD-L1 KO细胞暴露于增加量的EX-PD-L1 Flag，结果显示EX-PD-L1 Flag以剂量依赖性方式促进肿瘤生长。此外，与EX-PD-L1 KO或PBS共注射相比，具有EX-PD-L1 Flag共注射的4T1-PD-L1 KO肿瘤表现出更少的颗粒酶B表达，表明肿瘤区域中细胞毒性T细胞活性降低。这些结果表明EX-PD-L1通过抑制T细胞颗粒酶B的分泌来保护和促进体内肿瘤生长。这些发现与上述体外研究一致，体内结果同样证明外泌体的PD-L1可与PD-1结合并抑制T细胞杀伤活性。

上述IHC染色的结果显示PD-L1和外泌体标记物CD63在人肿瘤组织样品中的MVB中的共定位，他们试图进一步确定它们的共定位是否与患者乳腺癌的发展阶段有关。对一组人乳腺癌组织芯片的分析表明，与疾病的较高阶段相关的PD-L1-CD63共定位水平较高，这与最近关于外泌体中PD-L1水平相关的报道一致。根据上述结果，他们假设生长的肿瘤继续将exo-PD-L1分泌到肿瘤微环境中使T细胞功能失活，这可能诱导免疫治疗抵抗。为了探索靶向外泌体分泌增强免疫疗法功效的可能性，他们在小鼠模型中用外泌体分泌抑制剂GW4869与PD-L1抗体组合治疗肿瘤。首先，结果显示GW4869抑制4T1小鼠乳腺癌细胞的外泌体分泌。GW4869对外泌体分泌的抑制抑制BALB/c小鼠中的4T1肿瘤生长，但体外和免疫缺陷裸鼠中4T1细胞生长不受抑制，表明GW4869治疗本身不抑制4T1肿瘤生长，但可能通过调节抗肿瘤免疫，包括抑制exo-PD-L1分泌。因此，如所预期的，GW4869治疗显着增强了4T1肿瘤生长抑制中的抗PD-L1治疗功效。此外，为了特异性抑制4T1细胞的外泌体分泌，他们构建了Tet-on诱导型Rab27a敲低4T1细胞系。与先前报道一致，通过Dox处理敲低Rab27a显着抑制外泌体分泌，并且结果进一步显示Rab27a的敲低显着抑制4T1肿瘤生长。与GW4869治疗相似，肿瘤细胞中Rab27a敲低对外泌体分泌的特异性抑制显着增强了抗PD-L1治疗功效。因此，肿瘤细胞中药理学抑制剂（GW4869）和遗传方法（Rab27a敲低）对外泌体分泌的抑制显着抑制4T1肿瘤生长并增强抗PD-L1治疗功效。值得一提的是，通过敲除Rab27a或抑制剂GW4869治疗与抗PD-L1抗体治疗相比，肿瘤抑制作用相对深远，表明肿瘤细胞中分泌的外泌体PD-L1的阻断显着促进抗肿瘤免疫。此外，两者的结合导至更强的肿瘤抑制。

此外，尽管已经证明外泌体将PD-L1从PD-L1阳性转运到PD-L1阴性乳腺癌细胞，并且exo-PD-L1与T细胞上的PD-1结合以抑制T细胞活化和杀伤活性，据报道人类骨髓APC也表达PD-L1并且对免疫疗法有重要贡献。因此，他们还测试了含有PD-L1的外泌体是否可以将PD-L1转运至骨髓APC。他们检测到PD-L1从exo-PD-L1转移至人单核细胞系THP1（巨噬细胞和DC的前体）。流式细胞术分析的结果进一步揭示外泌体可以在体外将PD-L1 EGFP转移至人巨噬细胞和PBMC中的DC。在体内，IF染色结果显示EX-PD-L1 Flag使肿瘤浸润的巨噬细胞PD-L1 Flag呈阳性；然而，他们没有观察到DC中的阳性染色。目前尚不清楚为什么体内外泌体对PD-L1向DC的转移效率与巨噬细胞相比较低。这可能是由于较少量的DC和/或一些未知机制降低了肿瘤微环境中的效率。然而，结果表明PD-L1可以通过肿瘤微环境中含有PD-L1的外泌体转移到多种细胞类型，包括肿瘤细胞、巨噬细胞和DC（至少在体外）。因此，外泌体似乎充当运输载体以将PD-L1递送到肿瘤微环境中的不同细胞类型中以调节免疫监视。尽管尚不清楚表达PD-L1的巨噬细胞或DC是否也可能分泌外泌体-PD-L1，但结果表明，Rab27a敲除肿瘤细胞中外泌体分泌的阻断可抑制4T1肿瘤生长，GW4869治疗有类似作用。总之，该研究表明，来自肿瘤细胞的外泌体PD-L1在调节肿瘤微环境的免疫监视中起重要作用。

总的来说，目前的研究结果表明PD-L1通过其在外泌体中的存在发挥被动保护作用，同时也在主动防御中起作用，并且含有PD-L1的外泌体减弱肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫。此外，结果表明，外泌体PD-L1分泌的阻断有助于抗肿瘤免疫，并且外泌体分泌抑制和抗PD-L1治疗的组合具有改善临床中抗肿瘤反应的潜力。