【名师讲堂】傅启华教授：分子诊断技术临床转化应用的思考

傅启华教授在报告指出，分子诊断不仅能对早期疾病作出确切的诊断，也能确定个体对疾病的易感性，判别致病基因携带者并对疾病的分期、分型、疗效监测和预后作出判断。早期分子诊断并不是一门独立的学科，目前已成为实验诊断学的一个重要组成部分，成为一门新的学科——分子诊断学。傅教授分析了PCR技术，测序技术，生物芯片技术三种主要的分子诊断技术，并从发展历史、临床转化等方面出发作了思考及分享。

PCR技术衍生出很多其他技术，如：PCR产物电泳分析、PCR-RFLP、PCR-ASO、多重PCR、PCR/测序分析、定量PCR等等。PCR技术已广泛应用于检验医学，病毒DNA或RNA的定量PCR检测、血友病等遗传性疾病的基因诊断、癌基因或抑癌基因的检测、细菌的基因分型等等。

定性PCR

PCR技术是上个世纪80年代中旬发明的。定性PCR是最早应用的，可以用于很多检测,如基因突变检测，微生物检测等。定性PCR的优点主要有技术要求低、操作简单、价格便宜等等，它仅仅依据电泳通过判断微生物的有无，或者是某个基因突变的有无来判断疾病，其局限性主要是依据参照判断目标片段是否存在，准确性不高，实验可靠性有待提高，容易造成假阴性结果。

荧光定量PCR

上世纪90年代末，发展了荧光定量PCR，该技术发展以后，PCR技术在实验室里面得到了大大的推广应用。荧光定量PCR的优点很多，灵敏度高，准确性好，容易实现精确定量检测，重复性好；可半自动化和批量检测，24～48h内能得到结果，在高通量检测、价格低廉、可质量控制等方面具有突出优势，有望解决产前诊断技术资源的“缺口”问题。我国最早期使用传染病的PCR检测，如乙肝病毒，丙肝病毒等。从遗传性疾病检测方面看，荧光定量PCR具有局限性，它不能检测染色体平衡易位、倒位及低水平嵌合等。荧光定量PCR可以应用于染色体非整倍体、三倍体、母体细胞污染鉴定以及个体识别等方面。

数字PCR

本世纪初发明数字PCR，通过有限稀释将样本分配到独立区室，每个区室最多只有一个拷贝的模板，各区室进行独立平行扩增，通过荧光信号，计数阴性和阳性区室的数量，再通过Passion统计处理即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。

数字PCR经历了很长的发展时期，经历了早期数字PCR（反应体系大于5μl）——微室数字PCR（反应体系为33nl）——微流控数字PCR（反应体系为10pl）——微滴式数字PCR（反应体系为1pl）等阶段。

数字PCR的优点在于高灵敏度、绝对定量、高特异性、最低检测限低。缺点有耗材昂贵、操作较繁琐、反应单元的生成及转移过程中溶液的损耗、检测线性范围较窄、样本通量低及生成检测液滴耗时较长等。目前数字PCR多应用于稀有突变分析、拷贝数变异、DNA甲基化、核酸定量等方面。

一代测序发展

 

● 1954年，Whitfield等用化学降解的方法测定多聚核糖核苷酸序列。

● 1977年Sanger等发明的双脱氧核苷酸末端终止法，Gilbert等发明的化学降解法进行DNA测序，一代测序多为Sanger测序的方法。

● 80年代中期出现了以荧光标记代替放射性同位素标记、以荧光信号接收器和计算机信号分析系统代替放射性自显影的自动测序仪。

● 90年代中期出现毛细管电泳技术方法。目前一代测序的方法多用毛细管电泳技术。

Sanger测序技术的优点也很多，DNA序列测定“金标准”，很多下一代测序的结果要用Sanger测序法验证；读长比较长，目前读长可达1000bp；准确率高，高达99.999%，可发现新的变异位点；测序成本低，每千碱基对测序成本仅0.5美金；每天的数据通量可以达到600000 bp。缺点是检测敏感性较低，检测通量低。Sanger测序技术应用广泛，如单基因遗传病点突变、 Indel检测，NGS检测结果验证。

下一代测序技术（NGS)

2005年，下一代测序技术（NGS)开始发展。早期测序的成本很高，测一次要10万美金，发展到今天，进行一次全基因组测序大约1000美金。测序技术发展的速度很快，无论是技术还是机器的更新。下一代测序技术也叫做多通量测序，它是区分于Sanger测序的一种方法。它包括全基因组测序（Genome），用于产前诊断；全外显子组测序（Exome），用于发现、鉴定致病基因；靶向目标基因测序（Panel），用于临床分子诊断。

染色体芯片技术（CMA）也叫做基因芯片、DNA芯片（DNA chip)、DNA微阵列（DNAmicroarray)，它是利用核酸分子杂交原理，首先将一系列预先设计好的核酸探针（oligo or cDNA)有序地、高密度地排列在玻璃、硅片或尼龙膜等固体支持物上，制成DNA微阵列。目前统一称为染色体芯片分析（chromosomal microarray analysis,CMA）。在临床使用的CMA平台主要包括两种类型：CGH芯片和SNP芯片。

CMA的优点非常的多，能在全基因组范围内同时检测到染色体的缺失（deletion）和增加（duplication）；能检测到≥10%水平的嵌合体；分辨率高。缺点是设备昂贵，技术复杂；不能检测点突变和平衡易位。

目前CMA的应用面也很广泛，作为孤独症（Autism）、诊断不明原因发育迟缓（DD）、智力落后(ID)、自闭症（ASD）的首选检验项目。多发先天畸形(MCA)、重症智障的诊断率，从染色体核型分析的约5%提高到35～40%！大大提高了诊断效率！另外还有临床怀疑染色体失衡性疾病、不明原因反复流产、癫痫等方面的检测。在先天性心脏病的分子诊断方面，对于综合征型CHD，CMA的诊断效率为14.1～20.6%，对于单纯性CHD，CMA的诊断效率为4.3～9.3%。

 临床分子诊断中各种测序方法

根据疾病选择检测方法

不同的疾病需要根据疾病特点选择检测方法。数字PCR并不能代替定量PCR，数字PCR不适合做遗传性疾病或是感染性疾病的检测，但是非常适合无创产前检测，因为灵敏度非常高。目前国内涉及感染性疾病的检测和遗传性疾病检测这两个方面比较少，市场前景非常广阔。

国产产品严重缺乏，市场发展空间大

目前国内CMA数据库及国产产品严重缺乏。现有的国内数据库大多是CMA标本有差距的白种人，但实际上每个人群CNV都有差异。国内CHD的数据库也严重缺少，这项工作也急需开展。

目前国内使用的是国外的芯片，价格昂贵，而且使用的数据也是国外的数据，和国内的标准也是有差异的，因此，CMA发展空间巨大，市场利润也很丰厚。可以说，染色体芯片技术还有很长的路要走，不管是数据库还是国产产品，都是亟待解决的事情。目前国内也在开发适合中国儿童出生缺陷的基因芯片，希望在不久的将来可以投入到国内的市场使用。