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SMRT测序:医学诊断的应用

2018-5-18 11:21| 编辑: 纳兰烙烙| 查看: 1829| 评论: 0|来源: 菲沙基因

摘要: 短读长大规模测序已成为医学标准的诊断工具。但短读长测序技术有其固有的局限性,如读长短、片段化、GC偏移、PCR扩增偏好性、高重复序列和大型结构变异无法识别等。而单分子实时测序技术(SMRT)解决了短读长测序中 ...

短读长大规模测序已成为医学标准的诊断工具。但短读长测序技术有其固有的局限性,如读长短、片段化、GC偏移、PCR扩增偏好性、高重复序列和大型结构变异无法识别等。而单分子实时测序技术(SMRT)解决了短读长测序中遇到的这些难题。此外,SMRT提供更高的一致性和准确性,并能直接检测DNA的表观遗传修饰。第一个商业化的长读长单分子平台是基于PacBio的单分子实时测序技术(SMRT)的RS系统,现已发展成为RSII和Sequel系统。下面,本文将介绍SMRT测序运用在生殖、癌症、微生物和病毒基因检测中的创新。


现代医学基因组学的研究与诊断十分的依赖DNA测序。测序技术在整个人类的生命周期中都具有广泛的运用,从产前诊断到新生儿筛查,到罕见疾病诊断、遗传性癌症检测、药物基因组检测以及大量疾病的易感基因检测。甚至包括对后代进行筛选和植入前的基因诊断。


测序技术可以分为三个阶段:第一,第二和第三代测序。虽然早期的第一代技术提供了突破性的发现,但是测序的大变革始于“链终止”或双脱氧技术的发明,今天称为Sanger测序。Sanger测序准确率高,读长800-1000bp,通量低不适合大规模测序。Sanger测序仍常被称为“金标准”,通常用于诊断孟德尔疾病,并对高通量测序结果进行有针对性的验证。


21世纪的第一个十年带来了多种新的DNA测序方法的发展,相对于第一代测序的平台,第二代技术的读取时间要短得多同时测序通量更高。包括以Roche公司的454测序技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术。尽管读长相对较短具有一定的局限性,但这些测序技术在疾病研究、外体诊断、甚至整个人类基因组的研究以及临床研究中能快速寻找致病突变。短读长限制读取基因组复杂部分、重复区域等缺点阻碍了二代测序在变异诊断检测中的实用性。


三代测序技术与第二代测序技术方法有本质的区别。以Pacific Bioscience公司的单分子实时测序(Single molecule real time sequencing,SMRT)和Oxford Nanopore的纳米孔单分子技术为代表的第三代测序技术,能进行超长读长的读取(> 20kb)。第三代测序技术最大特点是无需进行PCR扩增,可直接读取目标序列,甚至直接检测表观遗传修饰,因此假阳性率大大减少,同时避免了碱基替换及偏置等常见PCR错误的发生。同时测序时间也只有几个小时,这在诊断中非常有吸引力。虽然简单和低成本的nanopore技术正在流行,并很可能代表未来的平台,但是SMRT测序目前更加成熟,因此SMRT测序在诊断应用中更广泛。

图1  SMRT三代测序的原理


双链DNA (A);发夹适配器连接(B);荧光标记的核苷酸(C);脉间持续时间(IPD) (D, right panel);6-甲基腺苷修饰(E, left panel);循环一致序列(CCS)(F-H, left panel);带有单遍错误率的线性序列(黑色核苷酸)(FG, right panel);高质量的一致序列(H,right panel)



二三代测序的比较

表1  PacBio 与Illumina 测序平台的比较

注:数据来自2017年11月,公司网址

 (www.pacb.com and www.illumina.com) 查询结果


从表1可以看出,PacBio序列更少读长更长。PacBio测序中DNA聚合酶是实现超长读长的关键之一,读长主要跟酶的活性保持有关,激光会对酶的活性造成损伤。由于在文库的构建测序过程中不需要PCR扩增,所以测序无GC偏好性。在与第二代平台的比较中,原始PacBio测序数据产生的随机误差,其错误率更高达到13-15%,但是这些错误是随机分布的。这种随机错误可以通过多次测序来进行有效的纠错。


运用领域

01

 串联重复序列


串联重复导至40多个神经及神经退性或神经肌肉疾病,但是,二代测序平台对这些串联重复序列进行测序比较困难,因为读长太短,无法跨越大多数的串联重复区域。SMRT测序研究的第一个串联重复序列是FMR1 CGG repeat。健康个体携带大约30个CGG,大部分被被一个或者两个AGG单位打断。而遗传性智力障碍和自闭症最常见的原因之一是携带200多个单位的CGG重复序列,导至脆性X综合征(FXS)。Loomis等人的研究表明,可以对一个全长突变等位基因750个单元的序列进行测序,该等位基因相当于2kb的100%GC含量的重复区域,另外这种突变会发生在母性遗传中,且风险与不断增加的重复大小和更少的AGG中断有关。SMRT测序可用于确定重复序列的大小和监测中断AGG单元的数量。

因此,SMRT测序被用于临床检测中妇女的产前遗传咨询,评估后代为FXS(43-45)儿童的风险。


02

 多态性区域


基因分型人类白细胞抗原(HLA)区域,对于诊断自身免疫性疾病,器官及干细胞移植器官都至关重要。该区域的基因具有高度的多态性,HLA-B是最易变的,2012年已经注释了>2000个等位基因。序列的高变异性使得这一区域很难用短读测序来读取。全长HLA可以分为三类,称为I类、II类和III类,目前主要研究的是I类和II类。对I类HLA等位基因的测序已经用PacBio- illumina方法和PacBio方法进行。许多大型的HLA分型实验室,如安东尼·诺兰研究所,正在利用或开发他们自己的SMRT测序。这使得已知的HLA等位基因的数量迅速扩大,并成为器官移植基因分型和血液干细胞移植的金标准。


03

 假基因


假基因是基因组上有编码基因序列非常相似的非功能性基因组DNA拷贝,假基因与同源功能基因之间具有高度相似性,但在使用二代测序技术时,两者之间存在显著差异。而三代测序的长读长可以跨越实际的基因区域用来锚定独特的区域或相位变异来区分假基因和实际的基因。在诊断中,通常针对特定的位点或感兴趣的区域来进行测序,从而有效的降低当前的SMRT测序平台的高成本。为特定的片段进行富集的最简单的方法是通过做一个PCR(最多10kb)来放大目标。为了区分样品,可以在PCR过程中直接通过引物添加barcode序列,或者在库制备过程中使用含有条形码的发夹适配器。因此,对于多种PCR产物片段的检测,只需要构建一个文库即可。此测序可以在短短几个小时内完成、文库的制备相对便宜,从而使复杂基因位点诊断在将来成为可能。


表2  SMRT在临床的应用


01

 生殖基因组学


生殖基因组医学和相关咨询,包括胚胎植入前遗传学诊断(PGD),很大程度上依赖于对胚胎、患者和父母的单倍型或等位基因的诊断能力。长读长的测序可以对目标基因实现扩增测序,用于确定胚胎是否有与患者同源的等位基因。在一个Treacher Collins综合征的家庭中,SMRT测序证实了一个TCOF1变异来自于父亲,它会影响基因的拼接并可能导至疾病。明显的新生突变,是由生殖细胞系嵌合的结果,确定损害的等位基因的频率有助于预测后代的发病率。对于多次流产和疑似“努南综合症”的夫妇,SMRT测序发现了一种导至PTPN11基因变异的疾病,在父亲的精子中占37%。因此可以预估之后怀孕的风险。


02

 癌症


在对癌症患者的治疗中,监测低频率的突变是非常重要的,因为这些低频率的突变可能导至恶性细胞的增值优势。慢性粒细胞白血病(CML)是一种由染色体9和22之间易位引起BCR-ABL1融合蛋白导至的血癌。CML患者通常使用酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)来抑制BCR-ABL1,但该疗法可以诱导点突变产生耐药性。因此,对CML患者的BCR-ABL1基因进行筛选,对TKI治疗的不良反应和对突变体的研究具有重要意义。


03

 病毒微生物医学检测


在传染病研究中,SMRT测序已经被用于分析流感病毒,乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和人类免疫缺陷病毒(HIV)(表3),丙肝病毒和艾滋病毒的RNA分子的长度大约9 kb,而乙型肝炎病毒是一种环状DNA病毒,大小为3 kb。这些病毒非常适合用SMRT测序进行研究,因为利用SMRT测序可以测出病毒基因组的全长序列。Bull等开发了一种分析方法,测序结果几乎涵盖了六种主要HCV基因型的整个序列。SMRT除了用于确定感染病毒的基因组序列外,还可以监测药物治疗产生的突变。


表3 医学相关的微生物SMRT测序


细菌基因组的测序,一个cell的SMRT测序通常可以提供足够的数据量,如大肠杆菌测一个cell可以组装成完成图。长读长和新算法使PacBio测序比第二代测序方法更完整、更精确。临床相关的细菌包括结核杆菌结核分枝杆菌,2011年在德国引起溶血性尿毒综合征的大肠杆菌菌株,以及沙门氏菌的菌株。Pacbio测序和HGAP也被用来组装致病性单细胞真核生物的基因组,如利什曼虫参考基因组,这种原生动物寄生虫每年导至30000人死亡。


虽然长读长十分利于微生物的组装,但是三代测序与二代测序还有一个区别是SMRT测序可以直接测定微生物的表观遗传修饰。DNA甲基化在细菌基因组中普遍存在,SMRT简化了微生物的表观遗传特性的分析。SMRT测序用于鉴别致命的细螺旋体的毒性,基因组序列在菌株中没有重大的差异,但是毒力菌株具有更高水平的甲基化。SMRT是微生物研究中一项真正革命性的技术,特别是对于简单序列的测序组装与表观遗传变异检测。


SMRT测序正在开辟新的诊断途径,比如串联重复、多态性区域测序、表观遗传学修饰等。长读长的测序在一些医学运用中正在成为金标准,如HLA分型。目前,虽然大规模的三代测序被成本及分析所阻碍,但这种情况会迅速被改变。除了测序的价格不断下降,客户不断增长之外,新的单分子测序技术如nanopore测序也很可能推动测序在临床检测领域的发展。就像第二代测序取代Sanger测序并开启了基因组医学的革命,第三代单分子测序平台很可能是下一个基因诊断的革命。

参考文献:

Ardui S, Ameur A, Vermeesch JR, Hestand MS. Single molecule real-time (SMRT) sequencing comes of age: applications and utilities for medicaldiagnostics. Nucleic Acids Research. 2018 Mar 16;46(5):2159-2168.

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